Praktikum k přednášce Molekulární ekologie
1. Základy
Programy a odkazy:
Laboratoř sekvenace DNA http://web.natur.cuni.cz/~seqlab/
Bioedit https://bioedit.software.informer.com/
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)
CodoneCode Aligner. http://www.codoncode.com/aligner/download.htm
Primer3Plus http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
GeneMarker https://softgenetics.com/information/downloads/ (tu jen na vyžádání)
https://genemarker.software.informer.com/2.6/ (tu snad rovnou)
Základní práce se sekvencemi
Sekvenujeme obvykle s pomocí sekční Laboratoře sekvenace DNA
http://web.natur.cuni.cz/~seqlab/
Sekvence nám pak přijde e-mailem jako soubor (obvykle s koncovkou .abi)
Úloha*:
(* obdoba této úlohy se může objevit v zápočtovém testu.)
Ze sekvenátoru přišly tyto sekvence: seq1 seq2 seq3 seq4
Sekvence prohlédněte, zkraťte je o nespolehlivě přečtené konce. Proveďte alignment a zjistěte, na kterých místech se sekvence liší.
Postup:
Nainstaluji si program Bioedit
Otevřu si jednotlivé soubory přes File - Open...
Kliknutím na název sekvence se dostanu do editačního modu, kde mohu smazat část
sekvence.
Alternativně mohu přepnout v okénku Mode ze Select/Slide na Edit. Sekvenci pak
označím a jednoduše smažu.
Sekvence mezi okny kopíruji pomocí příkazů z nabídky Edit hlavního menu programu
(Copy Sequence a Paste Sequence).
Pokud bych chtěl sekvenci "otočit", mohu zvolit v hlavním menu Sequence -
Nucleic Acid - Reverse Complement.
Když pak mám sekvence v jednom okně, označím si názvy těch sekvencí, které chci
alignovat.
Z hlavního menu programu zvolím Accessory Application - ClustalW Multiple
Alignment.
Nad alignovanými sekvencemi mohu zvolit pomocí poslední z ikon názornější formu
zobrazení rozdílů sekvencí. Shodná místa se zobrazí jako tečky.
BioEdit má řadu dalších šikovných funkcí. Prozkoumejte je metodou pokus-omyl.
CodoneCode Aligner
Sofistikovanější přístup nabízí CodoneCode Aligner. Jde o placený program. Má však šikovné demo.
Cvičné soubory
Navržení nových primerů
K navržení nových primerů lze použít například program Primer3Plus Program lze používat přímo přes webové rozhraní nebo si ho stáhnout do počítače.
Úloha*: (* obdoba této úlohy se může objevit v zápočtovém testu.)
Navrhněte primery pro tuto sekvenci tak, aby se v PCR produktu vyskytla zvýrazněná část:
GGGCATCAGGGGAGAAACAAAGTCCCCACATCAGCACCCAAAGCTGACATTCTCAT
AATTAAACTATCCCCTGTAACATATACATGTACATAATACAACAGTCTATGTATATCGTG
CATTATGTTATATTCCGCATCAATAATGCTTGAGTACTTTAAATGTTAATCGTACATAGT
ACATAACTGTATAATCGTACATATTAAGTTCTCCGAGCAGGAATAACAAGCACGTATAAT
AATGACAAGGTAGACTATAATACATAGTAGTATTGATCAACATAACACCAGCCCAGCATG
GATATTCATAGCCAAAAGTCACCTATAACAGGACATAAAACATTAGTCTATTGGTCGTTC
ATTAGCGCATTCAGTCAGTAACAATTCTCTTCAAAATGGATATCCCCTACCACAACTCAA
ACTTTTGATCTACCATCCTCCGTGAAACCAGCAACCCGCTCGGGAAATGTCCCTCTTCTC
GCTCCGGGCCC
Postup:
Použiji program Primer3Plus
Sekvenci zkopíruji do rámečku. Označím
oblast svého zájmu pomocí hranatých závorek.
Zkontroluji General Settings. Zmáčknu zelený čudlík
Pick Primers.
Základní práce s mikrosatelity (výsledky fragmentační analýzy)
Fragmentační analýza probíhá opět ve známé sekční Laboratoři sekvenace DNA
http://web.natur.cuni.cz/~seqlab/
Výsledky opět přijdou e-mailem (jako soubory s koncovkou .fsa).
_______________________________________________________________________
Úloha:
Co mi to přišlo za výsledky z fragmentační analýzy?
Ze sekvenátoru přišly tyto soubory: soubor1 soubor2 soubor3 soubor4
Nainstaluji si demoversi programu GeneMarker
nebo si koupím plnohodnotnou
versi.
Spustím program. Otevřu soubory pomocí příkazu Add Samples. Pustím Run (případně
zelená šipka nahoře).
Zadám panel: NONE, Size Standard: GS500_1, Standard Color: Orange, Analysis
Type: Fragment Animal. Dále ponechám původní nastavení.
Čtení alel usnadní vytvoření panelu
Další funkce programu vyzkoušejte metodou pokus-omyl.