GENETICKÉ METODY V ZOOLOGII

 

Přednáška a cvičení pro posluchače magisterského a doktorandského studia zoologie

přírodovědecká fakulta UK

 

Úvodní poznámky a cíle

Molekulární genetika ve vztahu k systematické a ekologické biologii

 

   Rozvoj genetických, zejména molekulárních, technik otevřel fascinující výhledy na zcela nové obzory biologie. Přesto se zdá, že obrovský pokrok a záplava nových, často neočekávaných, poznatků zatím příliš nezměnily naše pochopení základních problémů evoluce. Spíše se opakuje známá zkušenost z vývoje lidského poznávání, kdy objevné koncepce a změna paradigmat nastolily nové, dříve neznámé, otázky a rozpory. Výrazné rozšiřování znalostí o molekulárních mechanismech evoluční divergence stále zasahuje jen jednotlivé části genomu a do značné míry opomíjí funkci celku na úrovni organismu. Podrobné poznání „interního“ mutačního a rekombinačního procesu v genomu však bude nutné doplňovat také znalostmi o různých „externích“ dějích selekce a driftu, které působí na celého jedince. V zájmu celostního pochopení rozmanitosti života je nezbytné konfrontovat chování DNA s chováním organismu v jeho prostředí.

   Jednotlivé úrovně biologické diversity jsou vzájemně spojeny kauzálními vztahy a zpětnými vazbami v příčinné řadě genů, jedinců, populací, druhů, společenstev a ekosystémů. Přístup k pochopení struktury a dynamiky přírodní rozmanitosti proto musí být nutně multidisciplinární a zahrnovat metodologii rozličných deskriptivních i experimentálních oborů. Rychlý pokrok molekulární genetiky a prudká specializace jejích odvětví však vedou k logickému vzdalování od tradičních biologických oborů, založených spíše na pozorování a empirii, než na experimentu podloženém vyspělou technikou. Molekulární biologie na jedné a systematicko-ekologická biologie na druhé straně stojí před nebezpečím velice výrazné divergence a případné ztráty schopnosti navzájem komunikovat. Právě studium biologické diversity je pole, ve kterém je spolupráce a prolínání molekulárně-genetických a tradičních přístupů jedinečnou příležitostí k výraznému pokroku.

 

                     Význam mnohooborového přístupu ke studiu biologické rozmanitosti

 

   Všechny obory biologie směřují k pochopení evoluce organismů, která vyústila v dnešní obraz přírodní rozmanitosti. Každá biologická disciplína  má určité přednosti i zápory, ale jejich výpovědní schopnosti jsou zpravidla komplementární. Také systematické a ekologické disciplíny se progresivně vyvíjejí, i když snad nižším tempem než obecná a molekulární biologie. Současný pokrok systematické teorie umožňuje překonávat tradiční hranice a bezprostředně srovnávat  morfologické i molekulární datové soubory. Je potřebné si uvědomit, že velká část organismů na Zemi může být zkoumána pouze morfologicky nebo ekologicky, protože náročnost molekulárních metod dovoluje studium pouze velmi omezeného počtu modelových druhů. Taxonomický a systematický výzkum je dnes ovšem nemyslitelný bez příspěvku genetických metod. O tom svědčí úspěch aplikace cytogenetických, biochemických a molekulárních metod v rozlišování druhů a stanovení fylogenetických vztahů. Spojené úsilí genetiků, systematiků a ekologů vedlo k vyjasňování koncepce biologického druhu a umožnilo popis struktury a dynamiky přirozených hybridních zón. Pro ekologický a etologický výzkum znamená zcela převratnou možnost spolehlivé určování stupně příbuznosti, kterou nabízejí některé molekulární techniky. Distribuce vhodných markerů může být využita ve studiu lokálního toku genů, migrace a populační struktury. Srovnání charakteru proměnlivosti maternálně dědičné mtDNA s variabilitou autosomových sekvencí přenášených oběma pohlavími vede k vyjasnění podílu pohlaví na utváření populační struktury a možnému vysvětlení role sexuálních rozdílů v ekologii a etologii. Genetická sledování jsou dnes nepostradatelnou součástí druhové ochrany, která nemůže spočívat jen v péči o stanoviště a biotopy ohrožených forem. Molekulární techniky pronikají i do synekologických výzkumů, zaměřených například na složení potravy nebo charakter přírodních ohnisek různých parasitárních onemocnění.

 

                                                                Cíle cvičení

 

   Cvičení má poskytnou základní představu o využití genetických a molekulárních metod ve výzkumu biologie živočichů v přírodě. Cílem není poukazovat na přednosti či metodickou eleganci moderních přístupů ve smyslu jejich nadřazenosti tradičním zoologickým metodám. Naopak, cvičení je vedeno se snahou ukázat na nezbytnost propojování a spolupráce jednotlivých oborů a poskytnout konkrétní příklady úspěšnosti podobného postupu.

   Dalším záměrem cvičení je umožnit praktické seznámení a vyzkoušení vybraných molekulárních technik v řešení fylogenetických, systematických a evolučních problémů. Cvičení bude zahájeno několika bloky obecných přednášek, zaměřených na genetickou analýzu fenotypu, cytogenetické sledování chromosomů a karyotypů, biochemické studium proměnlivosti proteinů a enzymů, na přehled soudobých molekulárních metod a na praktické aplikace některých postupů. Po těchto přednáškách účastníci cvičení absolvují týdenní turnusové praktikum. Toto praktikum bude zaměřeno zejména na molekulární metody s cílem, aby každý účastník během týdne provedl sérii experimentů vedoucí k samostatnému a konkrétnímu výsledku.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Program

 

Analýza fenotypu

 

 

 

fenotyp a genotyp

 

znak a stav znaku

metrické a nemetrické znaky

meristické a plastické znaky

 

medelovsky dědičné znaky jsou ve fenotypu nalézány jen vzácně

 

genové interakce ovlivňující projev znaku

 

n      vazba genů

n      mnohonásobné alelické série

n      epistáze

n      pleiotropie

n      polygenní znaky

n      kvantitativní znaky

 

kvantitativní a kvalitativní znaky

 

dědivost (heritabilita), H

míra dědiční složky fenotypové proměnlivosti, určuje podíl dědičnosti a vlivů prostředí na projev znaku

V_P = V_G + V_E

V_G = V_A + V_D + V_I

/V_P - celková variance projevu znaku, V_G,E - variance závislá na genetických, resp. environmentálních vlivech/

 

realizovaná dědivost,  H = Y_F - Y / Y_P - Y

/Y_F - hodnota znaku u potomstva, Y_P - hodnota znaku u rodičů, Y - průměrná hodnota znaku/

skutečná dědivost, H = V_G / V_P nebo  H = V_A / V_P

 

měření dědivosti

nejčastěji jako podobnost znaku mezi příbuznými jedinci

 

 

signální fenotypy

 

mutace zbarvení

Mendelovy pokusy s rostlinami

polymorfismus zbarvení ulity u páskovek (Cepaea)

proměnlivost zbarvení krovek brouků

vzory proužkování u ještěrek

zbarvení a poddruhy ptáků

 

dědičnost zbarvení srsti savců

základem poznatky u asi 15 laboratorních a domácích druhů

n      pigmentová barviva (karoteny, hemoglobin, melaniny, trichosiderin)

n      eumelaniny a phaeomelaniny

n      melanocyty

n      šíření pigmentu a pigmentační centra

 

hlavní alelické série

n      A - agouti /podélná struktura zbarvení chlupu/

n      B - brown /proteinová složka pigmentových granulí/

n      C - albino /snížení počtu pigmentových zrn/

n      D - dilute /shlukování pigmentových zrn/

n      E - extension /změny množství eumelaninu/

 

příklad kočky domácí

A - agouti, T - tabby,  B - brown, O - orange, S - white spotting, W - white, L - long hairs

 

příklady dalších druhů savců

rejsec, křeček, norník, hraboš, levhart, norek, kůň

 

homologie zbarvení

akromelanismus

melanismus, adaptivní význam, Glogerovo pravidlo

sezónní změny

disruptivní zbarvení

geny tečkování nebo pruhování

 

nemetrické (epigenetické) znaky

 

výběr znaků

statistické hodnocení

n      variabilita

n      mean measure of divergence (MMD)

n      measure of uniqueness

 

fenetika, fenogeografie

fluktuační asymetrie

 

příklady u různých živočichů

žilnatina křídel hmyzu, skelet a zuby savců

 

 

homeotické mutace u octomilek a obratlovců

 

 

biochemie krevních skupin savců

příklady rozšíření některých alel u člověka

 

                                           Cytogenetika

 

 

 

základní pojmy

 

studium chromosomů a karyotypů

termín chromosom: W. Waldeyer (1888)

karyotyp: uspořádaná sada chromosomů v buňce

klasifikace typů chromosomů podle polohy centromery

sekundární konstrikce a organizátor jadérka

 

životní cykly organismů a změny ploidie

narůstání velikosti genomu v evoluci

heterochromatin a euchromatin

typy chromosomových mutací

rovnovážné a nerovnovážné změny

tempo chromosomové evoluce

 

 

přitažlivost cytogenetiky spočívá v tom, že zahrnuje různé úrovně organizace,

od molekulární po morfologickou

n      obsah DNA v buňce a ontogenetické tempo

n      úrovně ploidie a reprodukční systém

n      počet chromosomů, úroveň rekombinace a význam numerických odchylek

n      morfologická manifestace počtu a velikosti chromosomů

n      uspořádání chromatinu a regulace genové exprese

n      poloha jednotlivých genů, mapování genomu

 

 

metodologické mezníky ve studiu chromosomů

n      objev hypotonického působení na metafázní chromosomy

n      kultivace leukocytů krve

n      vyvinutí technik proužkování chromosomů

n      techniky hybridizace

n      imunochemické techniky značení hybridizačních sond, FISH

 

 

vyšetření mitotických chromosomů

n      vyhledání tkáně s vysokou mitotickou aktivitou

n      extrakce nebo kultivace buněk (PHA a jiné mitogeny)

n      zastavení mitotického cyklu in vivo nebo in vitro

n      hypotonické působení

n      fixace

n      příprava preparátů (squash nebo splash)

n      polytenní chromosomy a jejich studium

vyšetření meiotických chromosomů

n      průběh meiose a význam jednotlivých stádií

n      odběr pohlavních buněk

n      synaptonemální komplexy

n      kartáčové chromosomy a jejich studium

 

 

proužkování chromosomů

n      Q, G, R, C barvení

n      barvení organizátorů jadérka (NORs)

n      fluorescenční barviva (chromomycin A₃, Hoechst 32258, DAPI)

n      specifická barvení - identifikace homologních nebo pohlavních chromosomů

n      restrikční endonukleázy

 

 

chromosomy a monitorování mutagenních vlivů prostředí

n      chromosomové aberace, typy a význam

n      mikronukleus test

n      somatické výměny (BrdU)

 

 

in situ hybridizace

n      příprava a značení sond (radioaktivní, neizotopové)

n      autoradiografie

n      hybridizační reakce sondy a cílové molekuly

n      odstranění nenavázané nebo nespecificky hybridizované sondy

 

 

fluorescenční detekce míst hybridizace - FISH

n      specifická vazebná reakce mezi antigeny a protilátkami

n      konjugace s avidinem a biotinem

n      fluorescenční značení mono- a polyklonálních protilátek

n      vizualizace signálu fluorochromy a jeho zesílení

n      identifikace chromosomových homologií (syntenie)

n      CISS, chromosome in situ supression hybridization

n      PRINS, primed in situ labelling

n      GISH, whole genome in situ hybridization

n      FACS, fluorescence activated cell sorting

n      vybarvování chromosomů, chromosome painting

 

 

vybavení cytogenetické laboratoře

n      standardní cytologická technika

n      mikroskopická technika (elektronový mikroskop, konfokální mikroskop)

n      zařízení pro sterilní práci a buněčné kultury

n      základní vybavení pro molekulární biologii

n      počítačové image programy

 

                                        Biochemická genetika

 

 

 

základní pojmy

 

první široce použitelná metoda studia genetické proměnlivosti a struktury přírodních populací

identifikace záměn aminokyselin v proteinovém řetězci

rozřešení otázky modelu genetické struktury populací

úroveň genetické proměnlivosti v populacích

adaptivní význam proměnlivosti

teorie neutrální evoluce

 

principy elektroforézy

 

obecně znamená pohyb částic v elektrickém poli

detekce záměny aminokyseliny vedoucí ke změně celkového náboje proteinu

tři aminokyseliny s pozitivním nábojem (Arg, Lys, His),

dvě s negativním nábojem (Asp, Glu)

pohyb makromolekuly určován její konformací, celkovým nábojem a pH pufru

stabilizace elektrického náboje specifickým pufrem

allozymy a isozymy

 

základní metody

n      vertikální

n      horizontální

n      kapilárová

n      v kontinuálním pufru

n      v diskontinuálním pufru (multifázická), izotachoforéza

n      izoelektrická fokusace  (IEF)

n      v močovině a SDS

n      dvourozměrná (2-D)

 

nosiče

n      škrob (SGE), pohyb závisí na velikosti částic a náboje (Smithies 1955)

n      celulózoacetát (CAGE), velikost náboje

n      agar, agaróza, velikost náboje

n      polyakrylamid (PAGE), velikost částic a náboje

 

schopnost separace

n      CAGE: 5 pruhů

n      SGE: 15 pruhů

n      PAGE: 19 pruhů

n      IEF >30 pruhů

n      2-D: asi 300 skvrn

 

detekce proteinů

histochemické barvení s využitím katalytických schopností enzymů (Hunter a Moeller 1957)

n      nespecifická detekce (amidočerň, Coomassie Brilliant Blue R)

n      specifická detekce (barviva pro glykoproteiny a lipoproteiny nebo barvení enzymů při štěpení specifického substrtátu)

n      redukce NAD/NADP

n      zymogram a elektroforetogram

 

vlastní postup

n      odebrání tkáně

n      uchování při nízké teplotě

n      homogenizace

n      aplikace vzorku na médium (pipetování, filtrační papírky, dávkovače)

n      zapojení proudu (vlastní elektroforéza)

n      barvení

n      čtení gelů, interpretace, statistické zpracování

 

omezení metody

n      problém s homologizací pruhů, stejné elektromorfy nemusí představovat ortologní proteiny

n      jen asi třetina neredundantních substitucí vede ke změně elektrického náboje

n      nelze detekovat mutace, které nejsou transkribovány nebo translatovány

n      nekódující sekvence nezachyceny

n      možné určení rozdílností, nikoliv shody

n      použitelné jen rozpustné (globulární) proteiny

 

aplikace

 

intraspecifická analýza

n      populační struktura a variabilita

n      studium inbrídingu a migrací

n      určení paternity

n      adaptivní význam změn

n      mezirasová hybridizace

n      určení druhové hranice

 

interspecifická analýza

n      mezidruhová hybridizace

n      rychlost evoluce

n      speciace

n      fylogeneze

 

 

 

 

 

 

 

                                         Molekulární genetika

 

 

 

úvodní pojmy

 

n      význam molekulárních metod v systematice a ekologii

n      charakter a rozsah genetické diversity

n      obsah DNA v jádře a jeho evoluční změny

n      struktura genomu a mutační tempa jednotlivých frakcí

n      repetitivní DNA

n      jaderná a mimojaderná DNA

n      neutrální evoluce a molekulární hodiny

n      horizontální přenos genů

 

 

odběr a uchovávání vzorků

n      nativní buňky a tkáně

n      etanol

n      stabilizační pufry

n      nízké teploty

 

extrakce DNA

n      centrifugační izolace mtDNA

n      odstranění proteinů (proteináza K)

n      fenol-chloroformová extrakce

n      precipitace DNA v alkoholu

n      separace jaderné a mtDNA ultracentrifugací v gradientu CsCl

 

hybridizace DNA

Kvantitativní odhad genetické divergence mezi genomy. Neumožňuje rozeznání diskrétních variant ani povahy proměnlivosti sekvencí. Aplikuje se u unikátní DNA.

n      oddělení repetitivní a unikátní DNA

n      denaturace DNA zahřátím

n      hybridizace, homo- a heteroduplex, tracer a driver

n      reasociační kinetika a reakční podmínky

n      indexy genetické vzdálenosti

n      hybridizace se specifickou sondou

n      příprava a značení sond

 

polymerázová řetězová reakce (PCR)

Syntéza mnoha kopií vybrané sekvence DNA probíhající v diskrétních cyklech.

Po n cyklech získáme 2ⁿ - násobné množství DNA.

n      cílová sekvence a primer (očko)

n      získání primerů

n      DNA denaturace

n      hybridizace primerů

n      Taq polymeráza a extenze primerů

n      ověření čistoty primerů

n      dvojitá (nested) PCR

 

restrikční analýza

n      restrikční endonukleázy

n      elektroforéza DNA

n      agarózové a polyakrylamidové gely

n      kalibrační standardy

 

proměnlivost délky tandemově opakovaných motivů

(VNTR, variable number of tandem repeats)

n      změny v počtu tandemově opakovaných sekvencí

n      distribuce VNTRs v genomu

n      mikrosatelity (SSRs, single sequence repeats) - vyhledávání, amplifikace, typování

n      minisatelity a DNA fingerprinting

 

proměnlivost konformace fragmentů

n      SSCP, single-strand conformation polymorphism

n      DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis

 

proměnlivost restrikčních míst

n      proměnlivost délky restrikčních fragmentů (RFLP, restriction fragments length polymorphism)

n      detekce změn sekvencí uvnitř PCR primerů  (RAPDs, random amplification of polymorphic DNAs)

 

sekvencování DNA

n      výběr cílové sekvence s příhodnou variabilitou

n      izolace mnoha kopií, purifikace

n      sekvencování

n      seřazení homologních sekvencí

 

n      klonování, genomické knihovny, vektory

n      Maxam-Gilbertovo (chemické) sekvenování - bázově specifické modifikace DNA a následující štěpení specifickými činidly

n      Sangerovo (dideoxy-) sekvenování - kontrolované přerušování enzymatické amplifikace s využitím dideoxynukleotidových analogů v extensi DNA řízené primerem

n      čtení sekvenčních gelů

n      automatické sekvenování

n      databáze, genomika

 

aplikace

n      molekulární skatologie

n      analýza fosilní DNA

n      populační struktura, určování příbuznosti

n      určování pohlaví

n      konstrukce rodokmenů

n      fylogeografie

n      ochrana druhů