BLOK 2: TVORBA ALIGNMENTU

Programy: Clustal W, Clustal X (stejné jako Clustal W s rozhraním pro Windows) - ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/ jsou klasikou tvorby alignmentu. Nejsou nejlepší, ale jsou poměrně rychlé a většinou dostačují. V našem kurzu budeme používat algoritmus Clustal integrovaný v editoru BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Sofistikovanější programy pro tvorbu alignmentu jsou například tyto: 

Dialign - http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/bibi/Tools_Alignments.html

T-coffee - http://www.igs.cnrs-mrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi

Macaw - http:/iubio.bio.indiana.edu:7780/archive/00000057/

Na začátku se vyplatí nechat parametry nastavené jak byly, případně spíše zvyšovat penaltu za otevření gapu a snižovat penaltu za prodlužování gapu (u algoritmu Clustal). Pokud se jedná o proteinový gen, je lepší utvořit alignment na základě sekvence aminokyselin. Při překladu z DNA na aminokyseliny pozor na čtecí rámec a odlišné genetické kódy (nálevníci atd. ). Lze najít v GenBanku v informacích o sekvenci (codon start=2, translation table=6). 

Alignment založený na sekundární struktuře RNA

Lze stáhnout z internetu (http://www.psb.ugent.be/rRNA/). _{Tento alignment je možné použít jako matrici a přialignovat k němu vlastní sekvence  v programu ClustalX volbou alignment →  realign selected sequences.}

Rady pro tvorbu alignmentu v programu BioEdit:

• Vstupní formát sekvencí a alignmentů – FASTA, GenBank, Phylip, Clustal, Nexus a další.
• Pokud chcete se sekvencí něco dělat musíte ji označit poklepnutím na název (zčerná), Edit → Select all sekvences (CTRL+A) vybere všechny.
• Dvojitým poklepáním na název otevřete dialog o sekvenci. Červenou šipkou vpravo dole otevřete a zavřete podrobné informace o sekvenci.
• Vybrané sekvence zalignujete volbou Accessory applications → Clustal W multiple alignment. V Clustalovém dialogu zrušte volbu Bootstrap NJ tree. Parametry nechte pro začátek nevyplněné (default). Klikněte na tlačítko Run ClustalW. Alignment se otevře v novém okně.
•  Vybrané sekvence lze trvale translatovat nebo reverzně translatovat volbou Sequence → Translate or reverse translate (permanent). Informace o sekvenci nukleotidů bude v tomto případě po translaci ztracena. Volba Sequence → Toggle translation (CTRL+G) umožňuje provést translaci sekvence “nanečisto” s možností návratu zpět opakovanou volbou Toggle translation (i po alignování sekvencí). “Nanečisto” translatované sekvence se při uložení souboru vrátí do původního stavu.
• Čtecí rámec sekvence lze snadno měnit přidáváním gapu “.” na začátek sekvence. Reverse complement sekvence DNA získáme volbou Sequence → Nucleic Acid → Reverse complement (SHIFT+CTRL+R). Volba Sequence → Nucleic Acid → Gap beginning to minimize stop codons in reading frame 1. Umožní rychle odhadnout čtecí rámec sekvence.
• Správnost translace je dobré ověřit pomocí blastp proti databázi GenBank. Accessory applications → BLAST → NCBI BLAST over the internet.  V dialogovém okně zvolte Program:blastp a Database:nr. Klikněte na tlačítko Search dole uprostřed. Výsledek se zobrazí v internetové prohlížeči.

Po vytvoření alignmentu programem je potřeba alignment prohlédnout a upravit.

1. Zarovnat začátek a konec.
2. Smazat místa, u kterých není jistota, že byla správně zalignována (mnoho gapů a velmi rozdílné sekvence).
3. Smazat pozice s gapy (někdo doporučuje, někdo ne).

Existují programy, které ořežou alignment za Vás: Gblocks (http://molevol.ibmb.csic.es/Gblocks/Gblocks.html), SOAP (http://evol-linux1.ulb.ac.be/ueg/SOAP/main.html). Kontrola okem je však i pak nutná!

Rady pro úpravu alignmentu v programu BioEdit¨

• Nukleotidy/aminokyseliny vyberete poklepnutím nebo tažením myši. Celý sloupec vyberete klepnutím nebo tažením v oblasti pravítka nad první sekvencí. Ve volbě Edit naleznete dole funkce na hromadný výběr Select all residues of selected sequences, Select to beginning, Select to end. 
• Rozbalovací menu Mode: vlevo nahoře nabízí volby:
  1. Select/slide – umožňuje posouvat vybraná rezidua 
  2. Edit – umožňuje v sekvenci psát a mazat klávesami Delete a Backspace
  3. Grab&Drag – umožňuje tlačit rezidua před sebou.
• Gap označený takto „-“  je uzamčený a chová se jako reziduum, tj. nepřejedete přes něj při posouvání. Gap označený takto ”~” je otevřený. Přepnout mezi otevřenými a uzavřeným gapy lze tlačítkem s visacím zámkem pod volbou Mode.
• Tlačítka vedle visacího zámku slouží k vkládání a mazání otevřených gapů. Tlačítka dále vpravo umožňují přepínat mezi různými druhy zobrazení

  Samostatná úloha 2

  Ze stažených sekvencí primátích genů pro cytochrom B utvořte alignment na základě proteinových sekvencí. Alignment uložte jednak ve formě DNA jednak ve formě aminokyselin. Oba alignmenty upravte.