Nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky

1. Úvod

Nitrované polyaromáty (NPAH) patří mezi vysoce nebezpečné mutagenní látky, jejichž přítomnost v životním nebo pracovním prostředí lze příčinně spojovat s vyšším výskytem rakovinových onemocnění. Zvýšený zájem o tyto látky se datuje od roku 1978, kdy bylo zjištěno, že NPAH mohou vznikat v silně znečištěné atmosféře reakcemi polyaromátů s oxidy dusíku. Některé NPAH jsou do atmosféry přímo emitovány spalovacími motory. Další zvýšení zájmu o tyto sloučeniny přineslo zjištění, že NPAH jsou odpovědny za podstatnou část přímé mutagenity extraktů pevných částic z ovzduší a výfukových plynů. Značné úsilí bylo věnováno detekci NPAH v různých typech environmentálních vzorků. Pozornost se rovněž zaměřila na další vysoce mutagenní sloučeniny, které mohou vznikat z NPAH během metabolických přeměn.

2. Vznik a výskyt nitrovaných polyaromátů

Nitrované polyaromáty byly nalezeny v ovzduší, výfukových plynech dieselových i benzínových motorů, v sazích, emisích spaloven, v sedimentech, cigaretovém kouři, potravinách. Mezi významné zdroje NPAH v ovzduší patří emise ze spalovacích motorů. Ve vzorcích částic, které jsou produkovány dieselovými motory bylo určeno přibližně padesát NPAH, přičemž převládající komponentou je 1-nitropyren. Dalšími látkami přítomnými v těchto vzorcích jsou 3-nitrofluoranthen, 8-nitrofluoranthen, deriváty anthracenu, fenanthrenu a mnohé další. Další výzkum se zaměřil na studium mechanismů, vedoucích ke tvorbě NPAH za atmosférických podmínek. Typickými představitely NPAH, které vznikají výhradně atmosférickou transformací PAH jsou 2-nitropyren a 2-nitrofluoranthen. Předpokládají se dva odlišné mechanismy vzniku těchto látek. Během dne převládá mechanismus iniciovaný atakem OH radikálu na plynný PAH, následovaný adicí oxidu dusičitého a eliminací vody podle níže uvedeného schématu. V noci za nepřítomnosti světla se zřejmě uplatňuje reakce PAH s oxidem dusičným.

Mechanismus tvorby 2-nitropyrenu v atmosféře

3. Biologické účinky nitrovaných polyaromátů

Řada NPAH je při Amesových testech prokazatelně mutagenní, a to i bez metabolické aktivace. Některé z nich, jako např. dinitropyreny, patří mezi vůbec nejsilnější testované mutageny. Mutagenními či karcinogenními účinky těchto látek se zabývalo již více než sto prací, přehled genotoxických účinků vybraných NPAH je uveden v níže uvedené tabulce. NPAH vstupují do organismu zpravidla dýchacími či trávicími cestami, mohou však být snadno a rychle absorbovány i kůží. NPAH jsou redukovány jaterními nitroreduktázami za vzniku sloučenin indukujících tvorbu methemoglobinu, např. nitrosoderivátů či N-hydroxylaminů. Tyto intermediáty jsou však dále redukovány až na odpovídající aminopolyaromáty (APAH), které jsou vylučovány močí ve volné formě či po acetylaci . Redukce NPAH v buňce je katalyzována reduktázami systému NADPH-cytochrom P-450, současně však může docházet i k C-hydroxylaci aromatického systému či k N-N dimerizaci výše uvedených meziproduktů. Za specifické toxické účinky aromatických nitrosloučenin zřejmě odpovídají reaktivní nitroaromatické anion-radikály, které snadno reagují s buněčnými nukleofily, zejména proteiny a nukleovými kyselinami. Tyto reakce mohou vysvětlit mutagenní a karcinogenní účinky řady aromatických nitrosloučenin bez ohledu na vlastnosti vznikajících APAH, které zpravidla rovněž vykazují silné genotoxické účinky. Genotoxicita NPAH obecně závisí jak na struktuře matečného PAH, tak i na počtu a poloze přítomných nitroskupin. Metabolická aktivace NPAH zahrnuje redukci nitroskupiny, oxidaci nitrovaného aromatického jádra, O-acetylaci vzniklého N-hydroxylaminu a v některých případech i kombinaci všech tří výše uvedených cest.

Genotoxické účinky nitropolyaromátů

sloučenina mutagenita karcinogenita
1-nitropyren ++ -/+
2-nitropyren ++ -/+
4-nitropyren ++ +
1,3-dinitropyren +++ +
1,6-dinitropyren +++ +
1,8-dinitropyren +++ +
1-nitronaftalen -/+ -
2-nitronaftalen -/+ +
9-nitroanthracen -/+ ?
2-nitrofluoren + +
3-nitrofluoranthen +++ +
6-nitrobenzo[a]pyren ++ -/+
7-nitrobenzo[a]anthracen -/+ -/+
6-nitrochrysen + +++

- neaktivní; -/+ velmi slabá; + slabá; ++ středně silná; +++ velmi silná

4. Metody stanovení nitrovaných polyaromátů

4.1 Odběr vzorku

NPAH vázané na tuhé částice při analýzách ovzduší nebo výfukových plynů mohou být zachyceny pomocí filtru ze skelných vláken a následně desorbovány organickými rozpouštědly.Extrakce se nejčastěji provádí v Soxhletově přístroji dichlormethanem, případně za použití ultrazvuku. Při velkoobjemovém vzorkování ovzduší může docházet ke zkreslování výsledků, neboť NPAH mohou vznikat při samotném procesu vzorkování. K odběru vzorku lze použít i různé typy denuderů. Vzorky krve pro stanovení NPAH se odebírají z paže exponovaných pracovníků, plasma se okamžitě oddělí centrifugací a deproteinizuje se přídavkem ethanolu. Nitropolyaromáty přítomné ve volné formě se extrahují isooktanem.

4.2 Předběžná separace a zakoncentrování

Vzhledem ke složitosti environmentálních, biologických a dalších vzorků je nezbytnou součástí většiny metod předběžná frakcionace extraktu. Provádí se nejčastěji vysokoúčinnou nebo sloupcovou kapalinovou chromatografií v systémech s normálními fázemi. Vhodnou metodou k předběžné separaci a prekoncentraci NPAH je rovněž extrakce tuhou fází, případně superkritická fluidní extrakce.

4.3 Chromatografické metody

Chromatografické metody jsou při stanovení NPAH v environmentálních i biologických vzorcích nejčastěji používány vzhledem k jejich mimořádné selektivitě, citlivosti a vhodnosti pro sériové analýzy. Detekce a charakterizace sedmi NPAH po jejich TLC separaci a redukci na základě zhášení fluorescence různými činidly byla popsána již v roce 1978. Ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) se nejčastěji používá systém s obrácenými fázemi na kolonách C18 a mobilními fázemi methanol/voda nebo acetonitril/voda. Nejčastěji používaným detektorem je spektrofotometrický detektor v UV oblasti, citlivost této detekce je však velmi nízká. Vyšší citlivosti je možno dosáhnout pomocí elektrochemické detekce. Zřejmě nejcitlivějšími detekčními technikami jsou metody založené na fluorescenci, případně chemiluminiscenci. Společnou nevýhodou těchto technik je nutnost redukce NPAH na příslušné aminoderiváty. Redukci lze provést off-line mimo vlastní HPLC systém nebo výhodněji on-line přímo v systému. Zajímavé možnosti při analýze NPAH nabízí i využití multidimensionální HPLC. Pravděpodobně nejúčinnější metodou pro identifikaci a stanovení NPAH je plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) umožňující identifikaci až 50 látek z této skupiny v jediném vzorku. Mezi další detektory použité k analýze NPAH metodou plynové chromatografie patří TEA ( thermal energy analyzer), NPD, ECD a FID.

4.4 Polarografické a voltametrické metody

Vzhledem ke snadné polarografické redukci nitroskupiny na aromatickém jádře lze ke stanovení stopových množství NPAH použít moderní polarografické a voltametrické metody, jmenovitě diferenční pulsní polarografii na klasické rtuťové kapkové elektrodě či diferenční pulsní voltametrii na visící rtuťové kapkové elektrodě. Zajímavá je existence vztahu mezi polarografickým půlvlnovým potenciálem a mutagenitou řady NPAH. Znalost mechanismu polarografické redukce těchto látek může být navíc cenným vodítkem při objasňování mechanismu jejich metabolické transformace.

4.5 Spektrometrické metody

NPAH je možno stanovit pomocí spektrofotometrie v UV oblasti. Fluorimetrie, která je velmi výhodná pro důkaz a stanovení PAH, nemůže být použita přímo pro NPAH, neboť tyto látky nevykazují prakticky žádnou fluorescenci. Pro analýzu NPAH je však možno využít jejich silnou fosforescenci při nízkých teplotách.