Stručný přehled přednášky Základy molekulární taxonomie
Jaroslav Flegr, 2002 (221951821, FLEGR@CESNET.CZ)

1) Zvláštnosti molekulárně  biologických znaků
  (x znakům klasickým): 
Z hlediska systematiky a fylogenetiky mají molekulární znaky ve srovnání se znaky klasickými, například morfologickými, řadu důležitých výhod.
Molekulárních znaků máme k dispozici prakticky libovolné množství.
Jednotlivé molekulární znaky jsou vzájemně distinktní.
Jednotlivé molekulární znaky jsou zpravidla kvalitativní a lze je proto lépe popsat.
Molekulární znaky nám umožňují porovnávat a třídit i vzájemně si zcela nepříbuzné a nepodobné organismy.
Molekulární znaky nemusíme vzájemně vážit.
Většina molekulárně biologických znaků je selekčně neutrálních, proto počet společně sdílených znaků mezi dvěma druhy odráží míru příbuznosti těchto druhů, nikoli míru podobnosti selekčních tlaků které na ně v minulosti působily.
Pro některé typy studií a pro řešení určitých typů otázek nepředstavují molekulární znaky rovnocennou náhradu znaků klasických.

2) Metody získávání experimentálních dat

 	‑GC/AT index, renaturační kinetika, hybridizace v roztoku, na membráně.
 	 ‑Restrikční endonukleázy, fingerprinting (mnoholokusová analýza), RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism), RE mapování metodou dvojí digesce, postupná hybridizace a parciální digesce, pravděpodobnost výskytu cílových míst, detekce fragmentů, restrikce unikátních a repetitivních sekvencí.
 	 ‑sekvenování DNA, genomová DNA x cDNA, manuální a automatické metody, odečet sekvencí z autoradiogramu.
 	 ‑PCR, PCR fingerprinting, RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA, AP‑PCR Arbitratily Primed PCR, PCR sekvenování, digitální PCR, mikrosatelity (SSRs Simple Sequence Repeats, STR, SSLP), minisatelity.
 	 ‑elektroforéza proteinů, SDS, nativní, metody detekce, isoelektrická fokusace proteinů, dvourozměrná elfo, isoenzymová a alozymová analýza
 	‑imunologické metody, protilátky, precipitace, imunodifuse, imunoelektroforeza, komplement fixační reakce CFR, microkomplement fixation MCF, radioimunoassay (RIA).

3) Databáze DNA a proteinů ‑Retrieve, ENTREZ, Gopher, WWW.
RETRIEVE@NCBI.NLM.NIH.GOV, ENTREZ@NCBI.NLM.NIH.GOV, GB‑SUB@NCBI.NLM.NIH.GOV, BLAST@NLM.NCBI.NIH.GOV, DATALIB@EMBL/HAIDELBERG.DE, AUTHORIN@NCBI.NLM.NIH.GOV, BLAST@..., FASTA@EBI.AC.UK, BLITZ@EMBL‑HEIDELBERG,DE, CBR@INF.ETHZ.CH (DARWIN)

4) Sběr experimentálních dat
Znaky x vzdálenosti, experimentální náročnost n nebo n2, ztráty informace
         ‑odčítání sekvencí
         ‑digitalizace elektroforetogramů
         ‑zjišťování delta Tm, GC/AT
         ‑vyhodnocení imunologických testů
         ‑hledání sekvenčních homologií (BLAST, PAM120)
         ‑sestavování restrikčních map
         ‑koeficienty podobností, divergence,
         ‑podobnost individuí/populací, Neiovská, Rogersova gen. vzdálenost
Využití tabulkových procesorů a specializovaných programů.

5) Biologické aplikace  dat
 	hromadění bodových mutací, molekulární hodiny, nekódující a 4‑degenerované pozice ‑ konstantní rychlost/rok, nesynonymní ‑ rozdíly mezi hlodavci a primáty (Ne, generační doba), rozložení mutací, podobnosti, jedno/dvou parametrické modely, K, p, výpočet množství substitucí z restrikčních fingerprint, z restrikčních map, mutace v kódujících oblastech, synonymní mutace, degenerované pozice, vliv struktury genetického kódu, vliv vlastností aminokyselin, introny, pseudogeny.
 	fenogramy, UPGMA (metoda párování pomocí nevážených aritmetických průměrů), UPGMA z  transformovaných vzdáleností, metoda sousedů (neighbor‑joining).
 	kladogramy, parsimonie, podmnožina interpretovatelných znaků, metoda maximální věrohodnosti (maximum likelihood).
 	evoluce druhů x evoluce genů, výpočet délky větví, zakořeňování dendrogramu, výpočet okamžiku větvení, velikosti populace.
 	koncisní dendrogramy, bootstraping, resampling
 	taxonomický software, Phylip, Paup, Hennig86, Mega, Treecon, CBR@INF.ETHZ.CH..
6. Metody rekonstrukce fylogeneze na základě molekulárně biologických dat
Některé molekulárně taxonomické metody získávání dat nám poskytují data znakového charakteru, jiné data distanční.
Fenetické metody třídí organismy na základě jejich vzájemné podobnosti, fylogenetické metody na základě jejich příbuznosti.
Pomocí vhodného modelu evoluce DNA či a proteinů můžeme na základě podobností sekvencí těchto biopolymerů u různých druhů vypočíst jejich přibližnou příbuznost a rekonstruovat tak průběh jejich fylogeneze.
Existují dva principiálně odlišné postupy vytváření fylogenetického stromu – pomocí výpočetního algoritmu a pomocí uplatnění kriteria optimality.

7. Evoluce DNA a proteinů
Na úrovni DNA patrně velkou část evolučních změn reprezentují selekčně neutrální mutace.
Frekvence fixací neutrálních mutací, tj. substituční rychlost, nezávisí na velikosti populace, podíl selekčně neutrálních mutací na celkovém počtu mutací a tedy i celková substituční rychlost je však větší v malých populacích.
Substituční rychlosti pro neutrální mutace zpravidla výrazně převyšují substituční rychlosti pro mutace selekčně významné; v genech vystavených intenzivní pozitivní selekci však může naopak převažovat fixace mutací selekčně významných.
Kumulace neutrálních mutací v průběhu fylogeneze může sloužit jako molekulární hodiny dovolující biologům datovat jednotlivé události fylogeneze.
Při využívání molekulárních hodin ve fylogenetice je nutno brát v úvahu, že se rychlost jejich chodu liší pro jednotlivé geny, jednotlivé taxony a dokonce se mění pro stejný gen a stejný taxon v průběhu času.
Různé geny u stejného organismu se vyvíjejí různou rychlostí a to i v případě, že do analýzy  zahrneme výhradně selekčně neutrální znaky.
Substituční rychlost i poměr nesynonymních ku synonymním mutacím se může pro jednotlivé geny v průběhu evoluce nepravidelně měnit.
Rozdíly v rychlosti chodu molekulárních hodin existují také mezi jednotlivými druhu organismů a jednotlivými taxony.
Délka generační doby ovlivňuje substituční rychlost pro neutrální mutace, selekčně významné mutace se fixují rychlostí více-méně nezávislou na generační době studovaných druhů.
Hlavním nedostatkem molekulárních hodin jsou příliš široké intervaly spolehlivosti při datování jednotlivých událostí kladogeneze.
Závažným problémem při využívání molekulárních hodin jsou i  obtíže s jejich kalibrací.

Metoda zjišťování počtu substitucí/nukleotid (K) srovnáním dvou sekvencí nukleových kyselin

1. Provedeme "alignment" (vzájemné přiřazení jednotlivých pozicí ve dvou molekulách biopolymeru) bodově maticovou nebo distanční metodou.

2. Spočteme p, tj. podíl pozic ve kterých se dvě srovnávané sekvence neshodují.

3. Provedeme matematickou korekci na vícenásobné mutace v jedné pozici některou ze standardních metod (Jukes a Cantor, Kimura, Tajima a Nei, Jim a Nei):

Jukes a Cantor (1969) jednoparametrový model

K=‑3/4 ln(1‑(4/3) p)

Kimura (1990) dvouparametrový model

K=‑(1/2) ln((1‑2P‑Q) (1‑2Q)‑2)
P...podíl pozic ve kterých došlo k transici
Q...podíl pozic ve kterých došlo k transversi

Zjišťování K na podkladě porovnání dvou restrikčních map (Nei a Li, 1979)

1. Sestavíme restrikční mapy (např metodou parciální digesce).

2. Pro obě sekvence (x,y) spočteme všechna restrikční místa Mx a My, a dále spočteme restr. místa společná pro obě sekvence Mxy.

3. Vypočteme podíl neshodných restrikčních míst, S
         S=2Mxy/(Mx + My)

4. Vypočteme odhad podílu pozic ve kterých se sekvence neshodují 
         p=1‑S1/r
r...počet nukleotidů v cílovém místě použité restriktázy
5. Vypočteme odhad počtu substitucí (K) z odhadu počtu neshodných pozic (p), např. Jukes Cantorovo metodou:

         K=‑3/4 ln(1‑(4/3) p)
(Metoda je  nespolehlivá, kdy  p je větší než  25%.)

Zjišťování K na podkladě porovnání dvou restrikčních vzorů (Nei a Li, 1979)

1. Provedeme digesci DNA a elektroforézu získaných fragmentů

2. Pro obě sekvence (x,y) spočteme všechny fragmenty Mx a My, a dále spočteme fragmenty společné pro obě sekvence Mxy.

3. Vypočteme podíl neshodných restrikčních fragmentů, S
         S=2Mxy/(Mx + My)

4. Vypočteme odhad pravděpodobnosti, že fragment zůstane od okamžiku divergence obou sekvencí nezměněn (G) metodou postupných iterací.

         G=(S(3‑2G))1/4
(v prvním kroku G=S1/4, celkem stačí asi 5‑7 iterací, tj. opakovaných dosazení výsledku G z levé strany do pravé strany rovnice)

5. Vypočteme odhad počtu substitucí (K) z odhadu G

         K=‑(2/r)ln(G)
r...počet nukleotidů v cílovém místě použité restriktázy

(Metoda je nespolehlivá kdy  elektroforetogramy obsahují méně  než  25% shodných fragment , tj. divergence je větší ne  15%)

Zjišťování K na podkladě DNA‑DNA hybridizace

1. Odstraníme repetitivní DNA (denaturací a rychlejší renaturací s následným odstraněním dsDNA).

2. Stanovíme střední teplotu tání homoduplexu, Tm, pro dvě srovnávané DNA (TmA, TmB) (neradioaktivní DNA (driver) v 1000 a vícenásobném nadbytku oproti radioaktivní (tracer), driver i tracer ‑ stejná DNA) a střední tepl. tání heteroduplexu, TmS, (driver a tracer ‑ dvě porovnávané DNA) 
3. Vypočteme rozdíl (dTm) mezi průměrnou střední teplotou tání homoduplexů a střední teplotou tání heteroduplexu.

         dTm=((TmA + TmB)/2) ‑ Tms

3. Vypočteme odhad podílu pozic ve kterých se sekvence neshodují 
p=c dTm
c...empiricky stanovená konstanta, c=0.01 (0.015)
4. Vypočteme odhad počtu substitucí (K) z odhadu počtu neshodných pozic (p), např Jukes Cantorovo metodou:

         K=‑3/4 ln(1‑(4/3) p)

(Jako měřítko genetické vzdálenosti se n kdy používá spíše parametr NPH - normalizované procento hybridizace, odrážející procento DNA je  reasociuje s cizí DNA (v porovnání s množstvím hybridizujícím s DNA vlastní), jiným obdobným parametrem je dT50H , který odráží jak pokles střední teploty tání, tak pokles množství DNA které hybridizuje. O vhodnosti dTm NPH nebo dT50H se zatím vedou spory.)

Zjištění genetické vzdálenosti mezi populacemi z frekvence alel

1) Na vzorcích jedinců ze dvou porovnávaných populací X a Y zjistíme frekvence i alel x1, x2, x3..xi a y1, y2, y3..yi pro L lokusů.

2) Vypočteme Rogersovu vzdálenost mezi populacemi podle vzorce

DR = (1/L)SUMA1((SUMA2(xj ‑ yj)2)1/2)/2
(SUMA1 ‑součet pro všechny lokusy, SUMA2 ‑součet pro všechny alely daného lokusu)

nebo vzdálenost dle Cavalli‑Sforza a Edwardse
DARC = ((1/L) SUMA1(2 cos‑1(SUMA2(xj yj)‑2)/pi)2)1/2
(SUMA1 ‑součet pro všechny lokusy, SUMA2 ‑součet pro všechny alely daného lokusu, pi = 3.14)

nebo Manhattanskou vzdálenost

DM = (1/L) SUMA1((1/2) SUMA2(ABS(xj ‑ yj)))
(SUMA1 ‑součet pro všechny lokusy, SUMA2 ‑součet pro všechny alely daného lokusu, ABS ‑ absolutní hodnota)

nebo Neiovskou vzdálenost

DN= - ln(JXY/(JX JY)1/2)

kde  JX,  JY ,JXY jsou aritmetické průměry ze SUMA(xi2), SUMA(yi2) a SUMA(xi yi) pro všechny lokusy (xi  a yi jsou frekvence i-té alely u druh  X a Y)

Testování platnosti Hardy-Weinbergova zákona metodou Chi2

1. 	Změříme pozorované četnosti jednotlivých genotypů AA, Aa, aa
2. 	Vypočteme četnosti  alely A (p) a alely a (1-p)
3. 	Vypočteme teoretické četnosti jednotlivých genotypů
 fAA=np2, fAa=2np(1-p),  faa=n(1-p)2
4. Vypočteme hodnotu Chi2     

CH2 = (FAA-fAA)/fAA + (FAa - fAa)/fAa + (Faa-faa)/faa

5. 	Ve statistických tabulkách nalezneme kritickou hodnotu   pro 2 stupně volnosti. Jestliže je námi vypočtená hodnot větší, odchyluje se populace statisticky významně od H-W rovnováhy. Tento test nám neřekne, zda jsou heterozygoti v nadbytku či naopak chybí a není vhodné ho používat pro kombinovaná data z několika lokusů. Test není ani příliš citlivý. Doporučuje se používat Smithova H statistika.

Testování platnosti Hardy-Weinbergova zákona z hodnot Smithovy H statistiky

1. 	Změříme pozorované četnosti jednotlivých genotypů AA, Aa, aa
2. 	Vypočteme četnosti  alely A (p) a alely a (1-p)
3. 	Vypočteme teoretické četnosti jednotlivých genotypů
 fAA=np2, fAa=2np(1-p),  faa=n(1-p)2
4. Vypočteme hodnotu H

H = (4n2p(1-p) - (2n-1)2np(1-p))/4n(n-1)

5. 	Spočteme celkovou H statistiku pro všechny lokusy
         r                                      r
H = ( (nr  - 0.5)Hr)/ (nr  -0.5)
         1                                     1

6. 	Vypočteme 95% interval spolehlivosti
                                   r
H  Z0.05 (p2 (1- p)2)/ (nr  -0.5)
                                  1         
Z0.05  = 1.96 pro velké soubory
Z0.05  = 2.0   pro n = 60
Z0.05  = 2.04 pro  n = 30

V případě, že  hodnota 0.0 bude ležet mimo interval spolehlivosti, lze uzavřít, že populace se na hladině významnosti 5% vychyluje z H - W rovnováhy. Jestliže je hodnota H kladná, je v populaci nadbytek homozygotů, jestliže záporná, nadbytek heterozygotů.

Konstrukce fenogramu metodou UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean, metoda párování pomocí nevážených aritmetických průměrů)

1. Sestrojíme trojúhelníkovou matici vzájemných vzdáleností mezi porovnávanými taxony (přesněji řečeno, mezi OTU, operačně taxonomickými jednotkami (operational taxonomic units).
2. Najdeme dvojici OTU s nejmenší vzájemnou vzdáleností, např. dAB vytvoříme z jejích členů (A,B) novou OTU (AB) a vytvoříme novou matici vzdáleností bez původní dvojice OTU ale s nově vytvořenou OTU. Vzdálenosti jednotlivých OTU od nově vytvořené OTU vypočteme jako aritmetický průměr vzdálenosti k jednotlivým členům nově vytvořené OTU.
např. dC(AB)=(dCA+dCB)/2

3. V nově vytvořené matici opět najdeme dvojici OTU s nejmenší vzájemnou vzdáleností a celý postup opakujeme. Jestliže máme vypočítat vzdálenosti dvou OTU z nichž každá je tvořena několika OTU např. 3 (I,J,K) a 2 (M,N) vypočteme aritmetický průměr vzdáleností všech dvojic OTU, pro které platí, že jeden člen dvojice je z jedné OTU a druhý z té druhé OTU.
d(IJK)(MN)=(dIM + dIN + dJM +dJN +dKM +dKN)/6

4. Celý postup spojování OTU opakujeme do té doby, až nám v matici zůstane pouze dvě OTU.

5. Sestavíme fenogram ve kterém pořadí větvení odráží (v opačném pořadí) historii spojování jednotlivých OTU.

Konstrukce fenogramu metodou UPGMA za podmínek předpokládané nestejné rychlosti vývoje v jednotlivých větvích

1. Sestrojíme trojúhelníkovou matici vzájemných vzdáleností mezi porovnávanými taxony (přesněji řečeno, mezi OTU, operačně taxonomickými jednotkami (operational taxonomic units).

2. Zvolíme outgroup OTU (nejméně příbuznou OTU, o které můžeme s jistotou předpokládat, že se od ostatních studovaných OTU oddělila nejdříve). Zde vycházíme z předchozích paleontologických či taxonomických znalostí, nebo z výsledků jednoduché UPGMA. Ve druhém případě nalezneme na fenogramu nejhlubší bifurkaci a OTU jedné větve použijeme jako OTU pro OTU větve druhé (a opačně).

3. Vypočteme matici transformovaných vzdáleností, d´, metodou Farris 1977)
d´IJ=((dIJ ‑ dID ‑ dJD)/2) + dD

i...i‑tá OTU
j...j‑tá OTU
D...outgroup
dD = SUMA(diD)/n (průměrná vzdálenost všech (n) OTU k outgoup)

4. Z matice transformovaných vzdáleností vypočteme fenogram (v tomto případě již spíše fylogenetický strom) pomocí UPGMA.

Konstrukce kladogramů metodou maximální parsimonie

1. Provedeme alignment sekvencí

2. Vybereme fylogeneticky informativní místa (FIM), tj. pozice, ve kterých se vyskytyjí minimálně dva různé znaky (např. nukleotidy), každý minimálně u dvou OTU.

příklad:
sekvence 1. AAGACTGCA
                2. AGCCCTGCG
                3. AGATTTCCA
                4. AGAGTTCCG
                                *   *   *
hvězdičkami jsou označena FIM

3. Sestavíme všechny potenciálně existující nezakořeněné binární stromy pro dané OTU (sekvence). Pro naše 4 sekvence existují 3 stromy:

           1)                          2)                         3)
      1                 3         1                 2        1                 2
       \________/            \________/           \________/
       /                \            /                \           /                \
      2                 4          3                4         4                3

4. Pro každé FIM dosadíme do každého z možných stromů příslušný nukleotid, a v bodech větvení takový nukleotid, který je z hlediska příslušných koncových větví stromu nejpravděpodobnější (vyžaduje nejméně mutací). Mutace v jednotlivých větvích stromů vyznačíme hvězdičkou.
            1)                         2)                            3)
Pozice 3
      G                 A          G                 C         G                    C
       \G______A/           *\A______A/*         *\A______A/*
      */    *           \             /                  \            /                   \
      C                 A          A                   A        A                   A
Pozice 4
      A                  T          A                 C       A                  C
      *\C______T/           *\T______C/           \A______T/*
       /        *        \*           /        *        \*      */        *       \
      C                  G         T                    G     G                  T
Pozice 9 (FIM3)
      G                  A        G                   G         G                  G
       \G______A/           *\A______A/*         *\A______A/*
       /       *         \            /                   \            /                   \
      G                  A        A                   A         A                   A

5. Spočteme celkový počet mutací ve všech uvažovaných stromech a vybereme si ten, který předpokládá nejmenší počet mutací. V našem případě je to strom 1 (pět mutací).

Pozn. 1
Nelze v praxi provádět bez počítače!
neboť:

počet možných zakořeněných stromů (NR) pro n OTU

NR = ((2n ‑ 3)!)/(2n‑3(n ‑ 2)!
počet možných nezakořeněných binárních stromů (Nu) pro n OTU je rovný NR pro n‑1 OTU

n        NR                             NU
2         1                  1
3         3                  1
4        15                 3
5       105               15
6       954              105
7     10395            954  
8    135135         10395 
9   2027025       135135
10 34459425    2027025

Poznámka 2.

Většina programů neprohledává všechny stromy, ale s využitím nejrůznějších heuristických algoritmů vybírá jen některé, nadějné. Hledání nejlepšího stromu tak trvá mnohem kratší dobu, ale zároveň může nejlepší strom minout. Výsledek prohledávání tak může záležet na pořadí, v jakém byly OTU seřazeny ve vstupním souboru, proto je u některých programů vhodné zpracovávat stejnou úlohu opakovaně (s proházeným pořadím OTU).

Poznámka 3.

Většinou nám program poskytne několik (často mnoho) stromů se stejným, nebo velmi podobným počtem mutací. Vybrat z nich ten správný je částečně záležitost speciálních metod k vytváření konsizních stromů (a příslušných programů), částečně matematických metod zjišťování statistické věrohodnosti stromů a jejich částí (bootstraping, resampling, určování intervalů spolehlivosti) a především zdravého rozumu.

Výpočet okamžiku divergence dvou sekvencí

1. Provedeme "alignment" (vzájemné přiřazení jednotlivých pozicí ve dvou molekulách biopolymeru) bodově maticovou nebo distanční metodou.

2. Spočteme p, tj. podíl pozic ve kterých se dvě srovnávané sekvence neshodují (případně samostatně  pro transice a transverse).

3. Provedeme matematickou korekci na vícenásobné mutace v jedné pozici některou ze standardních metod (např. Jukes a Cantor) a získáme tak celkový počet substitucí (vztažený na 1 nukleotid) ke kterým došlo v obou sekvencích od okamžiku jejich divergence od společného předka, K.

K=‑3/4 ln(1‑(4/3) p)

4.A Jestliže známe substituční rychlost, r, tj. počet substitucí na jeden nukleotid za rok, můžeme vypočíst dobu která uplynula od existence posledního společného předka obou sekvencí, T z množství substitucí na jeden nukleotid, tj. z K:

T = K/2r

Vzhledem k tomu, že substituční rychlost u jednotlivých genů a u různých druhů organismů je velmi proměnlivá (nesynonymní substituce u histonů 3 a 4 r=0, u interferonu gama r=2.8 . 10‑9, synonymní hydroxanthin fosforibosyl transferáza r=2.1 . 10‑9, albumin r=6.6 . 10‑9, není tento postup v praxi využitelný.

4.B Jestliže známe dobu T1, která uplynula od odvětvení společného předka obou studovaných sekvencí (A,B) od jejich společné sesterské skupiny a zároveň známe sekvenci příslušného genu od některého zástupce (C) této sesterské skupiny, potom můžeme vypočíst dobu T2 ,tj. divergence obou studovaných sekvencí

                            |
                            |
                            |
          ^               /\
           |              /  \   
           |             /    \   
           |            /      \      
     ^    |T1              /\       \        
      |    |          /  \        \        
      |T2 |         /    \        \             
                  A      B      C                  

T2 = (2KABT1)/(KAC + KBC)

Obdobně, jestliže známe T2 a chceme spočítat T1

T1 = (KAC + KBC)T2/2KAB

Při těchto výpočtech si musíme být naprosto jisti pořadím odvětvování všech tří druhů a dále musíme doufat, že v průběhu evoluce daných taxonů nedošlo k výraznějším změnám v substituční rychlosti.

Doporučená literatura:
<Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution.  Chapman & Hall, 1993<Hillis D.M. & spol.  Molecular systematics.  Sinauer Associates, Inc. 1996 
<Li W.-H.  Molecular evolution. Sinauer Associates, Inc. 1997
<Page R.D.M. Holmes E.C. Molecular Evolution. A phylologenetic approach. Blackwell Science1998 <Graur D. & Li W.-H.  Fundamentals of molecular evolution. Sinauer Associates, Inc. 1999
<Nei M. & Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford Univ. Press, 2000