High Performance Liquid Chromatography, HPLC


SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY

Jsou většinou založeny na rozdílné distribuci dělených látek mezi dvě různé nemísitelné fáze.
Zvyšují selektivitu a specifičnost v analytické chemii.
Lze je využít pro kvalitativní i kvantitativní analýzu (tj. důkaz, identifikaci a stanovení).

dělení srážením, elektrolýza, destilace, krystalizace, dialýza, extrakce
elektromigrační separační metody
chromatografie :
  a) plynová (GC) (adsorpční a rozdělovací)
  b) superkritická fluidní (SFC)
  c) kapalinová (LC)
       - kolonová (HPLC)
     (adsorpční, rozdělovací, gelová a iontově výměnná)
       - planární (plošná)
     (papírová (PC) a tenkovrstvá (TLC))



CHROMATOGRAFIE

Je separační (dělící) a současně i analytická metoda
(tj. poskytuje kvalitativní a kvantitativní informace o vzorku).
Využívá distribuce látek mezi dvě fáze: mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou).

různá hlediska dělení chromatografie
1) povaha mobilní fáze : plynová (GC), kapalinová (LC)
2) způsob provedení : kolonová (sloupcová), plošná (planární)
3) princip separace : rozdělovací, adsorpční, iontově výměnná, gelová, afinitní
4) pracovní způsob : eluční (analytická ch.), frontální, vytěsňovací
5) účel : analytická, preparativní (preparační)


PŘEHLED CHROMATOGRAFICKÝCH TECHNIK

Mobilní fáze : plyn (plynová chromatografie) GC
Stacionární fáze
  kapalina

    plynová rozdělovací chromatografie GLC
  tuhá látka
    plynová adsorpční chromatografie GSC

Mobilní fáze : kapalina (kapalinová chromatografie) LC
Kolonová
Stacionární fáze
  kapalina

    kapalinová rozdělovací chromatografie LLC
    gelová permeační chromatografie GPC
  tuhá látka
    kapalinová adsorpční chromatografie LSC
    iontově výměnná chromatografie IEC
Planární
Stacionární fáze
  kapalina

    papírová rozdělovací chromatografie PC
    tenkovrstvá rozdělovací chromatografie TLC
  tuhá látka
    tenkovrstvá adsorpční chromatografie TLC


VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, HPLC
Kapalinový CHROMATOGRAF




SEPARACE (DĚLENÍ)

probíhá v separační koloně, která obsahuje
stacionární (nepohyblivou) fázi = sorbent a mobilní (pohyblivou) fázi = eluent.
Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou afinitu ke stacionární fázi.
Různé analyty podléhají různé distribuci (rozdělování) mezi mobilní a stacionární fázi.
Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány).




DRUHY INTERAKCÍ

hydrofobní interakce (van der Waalsovy síly)

        

interakce dipól-dipól          vodíková vazba

        

elektrostatická interakce

        

Při postupu vzorku kolonou :
- se jednotlivé složky vzorku (analyty) dělí (→ dospějí do detektoru v různých retenčních časech)
- se zóny analytů rozšiřují

Termodynamika separace se zabývá vlivy, které ovlivňují
-velikost interakce mezi sorbentem a analytem
-zadržování (retenci) a zpožďování (retardaci) analytů
-rychlost migrace analytů kolonou
-rozdíl v retenčních časech analytů
-dělění analytů od sebe navzájem

Kinetika separace se zabývá vlivy, které ovlivňují
-rozšiřování (rozmývání) zón analytů během postupu kolonou
-šířky píků v chromatogramu

Termodynamika a kinetika separace spolu úzce souvisí a obě dvě určují, jak moc se sousední píky v chromatogramu překrývají; tj. jak dokonale nebo nedokonale jsou zóny sousedních analytů vzájemně odděleny.
Termodynamika i kinetika separace ovlivňují rozlišení sousedních píků v chromatogramu.




TERMODYNAMIKA SEPARACE

objem stacionární fáze Vs [ml]
objem mobilní fáze Vm [ml]
objemový průtok mobilní fáze Fm [ml/min]
lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min]
retenční objem i-tého analytu VR,i [ml]
retenční čas i-tého analytu tR,i [min]
mrtvý objem kolony VM [ml]
mrtvý čas kolony tM [min]
redukovaný retenční objem V'R,i [ml]
redukovaný retenční čas t'R,i [min]

    

    

    

    

    

    

Retenční objem je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou,
aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony.
Retenční čas je celkový čas, který příslušný analyt stráví v separační koloně.
Mrtvý objem kolony je objem eluentu, který musí projít kolonou,
aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony.
Mrtvý čas kolony je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován,
tj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako mobilní fáze.
Všechny analyty stráví v mobilní fázi stejný čas - mrtvý čas kolony.
Redukovaný retenční čas je čas, který příslušný analyt stráví ve stacionární fázi.


DISTRIBUČNÍ KONSTANTA (ROZDĚLOVACÍ KONSTANTA)

    


RETENČNÍ FAKTOR (KAPACITNÍ FAKTOR, KAPACITNÍ POMĚR)

    

    

    

KD,i a ki charakterizují selektivitu, tj. jak moc se analyty na koloně zadržují a zpožďují.


ZÁKLADNÍ ROVNICE CHROMATOGRAFIE

    
platí především pro rozdělovací chromatografii

    

    

    


SEPARAČNÍ MECHANISMY u HPLC
příčiny zadržování a dělení separovaných látek

Gelová permeační chromatografie (GPC)
využívá mechanického dělení molekul analytů v pórech gelu na základě jejich rozdílné velikosti.
Rozdělovací chromatografie (LLC)
využívá rozdílné rozpustnosti (a tudíž i rozdílné distribuce) molekul analytů mezi dvěma zcela nemísitelnými kapalinami.
Adsorpční chromatografie (LSC)
využívá rozdílné adsorpce molekul analytů na povrchu tuhé fáze s aktivními centry.
Iontově výměnná chromatografie (IEC)
využívá rozdílné výměnné adsorpce analytů (iontů) na povrchu iontového měniče.


KINETIKA SEPARACE

Zóny dělených látek (analytů) se během postupu kolonou rozšiřují.
Zóně analytu v chromatogramu odpovídá pík neboli eluční křivka, která charakterizuje koncentrační profil analytu v zóně.




TVARY PÍKU




ŠÍŘKA PÍKU

odráží šířku zóny příslušného analytu v koloně

a) šířka píku při základně
    
b) šířka píku v polovině výšky
    
c) šířka píku mezi inflexními body
    

Šířka píku se udává v délkových nebo časových jednotkách [mm, cm, s, min]

plocha píku :
    




ÚČINNOST CHROMATOGRAFICKÉ KOLONY

Účinnost kolony charakterizuje, jak moc se zóny separovaných látek na koloně rozšiřují.
Mírou účinnosti chromatografické kolony je:
a) počet teoretických pater dané kolony

    

b) výškový ekvivalent teoretického patra
  (porovnávání kolon různé délky)

    




PŘÍČINY ROZŠIŘOVÁNÍ ZÓN

1. Vířivá difúze
     - různé molekuly musí urazit různé vzdálenosti
2. Podélná molekulární difúze
     - molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa o nižší koncentraci
3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi
     - různé molekuly difundují různě hluboko do stacionární fáze
4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi
     - rychlostní profil mobilní fáze uvnitř kanálku je parabolický




VLIV RYCHLOSTI MOBILNÍ FÁZE NA ROZŠIŘOVÁNÍ ZÓN

Výškový ekvivalent teoretického patra (H) závisí na lineární rychlosti mobilní fáze (u).

    

    

1. Vířivá difúze
     ; tj. nezávisí na u

2. Podélná molekulární difúze
    

3. Odpor proti přenosu hmoty ve stac. fázi
    

4. Odpor proti přenosu hmoty v mob. fázi
    


    

    


VLIV RYCHLOSTI MOBILNÍ FÁZE NA ÚČINNOST KOLONY

van Deemterova rovnice

    

van Deemterova křivka



Minimum křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti, při které daná kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně rozšiřuje zóny analytů.


ROZLIŠENÍ PÍKÙ

Rozdělení dvou sousedních analytů může být dokonalé nebo nedokonalé.
Rozlišení charakterizuje míru relativní separace popř. míru vzájemného překrývání dvou sousedních píků.

    



      


FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ ROZLIŠENÍ

    

separační faktor :
        

faktor účinnosti
    a) rychlost toku mobilní fáze
    b) délka kolony
    c) průměr zrna, teplota, viskozita
faktor selektivity (velmi důležitý)
    a) změna stacionární fáze
    b) změna mobilní fáze
    c) rychlost toku mobilní fáze
faktor kapacity (k ≈ 3 až 10)
    a) množství stac. fáze v koloně
    b) změna stac. nebo mob. fáze
    c) teplota (v LC malý vliv)


ANALYTICKÁ INFORMACE Z CHROMATOGRAMU

RESULTS
--------------------------------------------------
Peak     RT(min)     Height     Area        W0,5
--------------------------------------------------
1         4.328      0.957        7.827     0.123
2        14.256      2.547       69.946     0.448
3        17.973      3.563      127.562     0.573
4        20.127      0.657       26.181     0.672
5        28.006      1.949      112.721     0.945
--------------------------------------------------

kvalitativní informace :
poloha píku - retenční čas → retenční faktor, distribuční konstanta - druh látky
(metoda standardů)

kvantitativní informace :
plocha píku → množství, koncentrace látky
a) metoda kalibrační přímky
b) metoda vnitřního standardu
c) metoda standardního přídavku


PUMPY

tlak mobilní fáze až do 40 MPa
čerpadla nebo lineární dávkovače




DÁVKOVACÍ KOHOUTY

mají dávkovací smyčku (dávkují se desítky μl)




KOLONY

Rovné skleněné trubice o délce 10 až 25 cm a vnitřním průměru 3 , 4 nebo 4,6 mm naplněné sorbentem o průměru zrn 3 , 5 nebo 10 μm, který je držen v kolně pomocí frit.




STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC

silikagel (oxid křemičitý) - polární, kyselý
alumina (oxid hlinitý) - polární, bazický
aktivní uhlí - téměř nepolární, jen zřídka


MOBILNÍ FÁZE pro LSC

eluční síla roste → pentan, benzen, chloroform, aceton, acetonitril, ethanol, methanol, voda


STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC

a) stacionární fáze mechanicky nanesené na inertním nosiči
     (ethylenglycol nebo skvalan na silikagelu)

b) stacionární fáze chemicky vázané (zakotvené) na inertním nosiči (tj. silikagelu)

   ≡Si-C18H37     -C8H17     -(CH2)3C6H5   nepolární
   -(CH2)3-CN     -(CH2)3-NH2     -O-(CH2)2-OH   polární


MOBILNÍ FÁZE pro LLC

a) chromatografie s normálními fázemi (stac. fáze polární a mob. fáze nepolární)
     pentan, heptan, chloroform a jejich směsi

b) chromatografie s obrácenými (reverzními) fázemi (RP-HPLC)
     (stac. fáze nepolární a mob. fáze polární)
     methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, voda a jejich směsi

isokratická a gradientová eluce


STACIONÁRNÍ FÁZE pro IEC

měniče iontů s nabitými funkčními skupinami
~COO-     ~SO3-     ~NH3+     ~CH2N+(CH3)3

~SO3-H+ + Na+ ↔ ~SO3-Na+ + H+
~NH3+OH- + NO3- ↔ ~NH3+NO3- + OH-


MOBILNÍ FÁZE pro IEC

roztoky anorganických kyselin a zásad o dané iontové síle a daném pH


STACIONÁRNÍ FÁZE pro GPC, GF, SEC

polystyren zesíťovaný divinylbenzenem a silikagel o určité velikosti pórů


MOBILNÍ FÁZE pro GPC, GF, SEC

vodné pufry (např. fosforečnanový, TRIS), acetonitril a kys. trifluoroctová (TFA)


DETEKTORY

1) absorpční fotometrický detektor



2) fluorimetrický detektor (fluorescenční det.)



3) refraktometrický detektor



4) amperometrický detektor



5) vodivostní detektor
6) detektor s diodovým polem (DAD)
7) hmotnostní spektrometr jako detektor


HPLC FUNGICIDÙ
extrahovaných dichlormetanem z ovoce

stac. fáze : Nucleosil 7 C18
eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH (pH 7,5) 40 % se 60 % methanolu

píky : 1. thiabendazol, 2. o-fenylfenol, 3. difenylamin, 4. ethoxychin, 5. bifenyl




HPLC DERIVÁTÙ PURINU

kolona : 30 cm x 4 mm
stac. fáze : Nucleosil 50-5
eluent : methanol / voda / dichlormethan 47 / 17 / 936 (v/v/v)
průtok eluentu : 0,8 ml/min při tlaku 100 bar
detekce : UV fotometrická při 280 nm

píky : 1. kofein, 2. theofyllin , 3. theobromin




HPLC BÍLKOVIN

kolona : 25 cm x 9,4 mm
stac. fáze : Zorbax GF-250
eluent : 130 mM NaCl + 20 mM KCl + 50 mM Na2HPO4 (pH = 7,0)
průtok eluentu : 1 ml/min
detekce : UV fotometrická při 210 nm

píky :
     1. myší IgM, Mh = 900 000
     2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000
     3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000
     4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000
     5. kuřecí albumin, Mh = 45 500
     6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700
     7. azid (tmax), Mh = 65




HPLC D,L ALANINU
chirální separace optických izomerů

kolona : 25 cm x 4 mm
stac. fáze : Nucleosil Chiral-1
eluent : 1 mM vodný roztok (CH3COO)2Cu (pH = 5,6)
průtok eluentu : 1,2 ml/min při tlaku 75 bar
teplota : 60 ˚C
detekce : UV fotometrická při 240 nm

píky : 1. D-alanin, 2. L-alanin




POLYAROMATICKÉ UHLOVODÍKY

kolona : 15 cm x 4 mm
stac. fáze : Nucleosil 5 C18 PAH
průtok eluentu : 0,9 ml/min při tlaku 100 bar
eluent : acetonitril / voda
     5 min 60% ACN, isokraticky
     60% → 90% ACN za 15 min, lineární gradient
     90% → 100% ACN za 20 min, lineární gradient
     20 min 100% ACN, isokraticky
detekce : fluorimetrická

píky : 1. naftalen, 2. acenaften, 3. fluoren, 4. fenanthren, 5. anthracen, 6. fluoranthen, 7. pyren,
8. benz[a]antracen, 9. chrysen, 10. benzo[e]pyren, 11. benzo[b]fluoranthen,
12. benzo[k]fluoranthen, 13. benzo[a]pyren, 14. dibenzo[ah]anthracen, 15. benzo[ghi]perylen,
16. indeno[1,2,3-cd]pyren



soubory pdf: hplcA.pdf    hplcB.pdf    hplcC.pdf

[ Domovská stránka | Separační metody | HPLC | GC | CES | CZE | MECC | CEC | TLC a PC | Extrakce, GPC, IEC a AC | Otázky | Cvičení | Témata | Základní praktika | Pokročilá praktika | Seminář z analytické chemie | Analytické separační metody ]

2.3.1996 © Pavel Coufal