CES

Capillary Electroseparations, CES

KAPILÁRNÍ ELEKTROMIGRAČNÍ SEPARAČNÍ METODY

1) Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
2) Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
3) Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC)
4) Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC)
5) Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF)
6) Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP)

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je vhodná pro separaci molekul s nábojem (iontů) lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem.

Kapilární gelová elektroforéza (CGE) umožňuje dělení vysokomolekulárních biologicky aktivních látek, jako peptidů, bílkovin, štěpů DNA a RNA.

Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC) využívající micel vytvářených povrchově aktivními látkami (detergenty), se s výhodou používá pro separaci neutrálních molekul i iontů.

Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC) kombinuje elektroforetický a chromatografický separační mechanismus a umožňuje dělení neutrálních i nabitých molekul.

Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF) dělí látky amfolytické povahy (tj. látky, které mohou nést kladný, záporný nebo žádný náboj podle pH okolního prostředí) v lineárním pH gradientu.

Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP) separuje ionty podle rozdílných elektroforetických mobilit.

Elektromigrační separační metody využívají dvou transportních jevů, elektroforetické migrace iontů v elektrickém poli a elektroosmotického toku kapaliny kapilárou.

Elektroforetickou migrací iontů rozumíme pohyb iontů v elektrickém poli vlivem elektrostatického přitahování elektrického náboje k opačně nabité elektrodě. Ionty různých poloměrů nesoucí různé náboje se v homogenním elektrickém poli pohybují konstantní elektroforetickou rychlostí, která je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a velikosti náboje iontu a nepřímo úměrná jeho poloměru.

Elektroosmotický tok (elektroosmóza, EOF) je tok kapaliny kapilárou, v níž je vytvořeno elektrické pole vložením napětí desítek kilovoltů mezi elektrody na koncích kapiláry. Naplníme-li kapiláru z taveného křemene roztokem nějakého elektrolytu, dochází k disociaci křemičitanových skupin na vnitřní stěně kapiláry. Vnitřní povrch kapiláry tak získává negativní náboj a uvolňované vodíkové protony vytvářejí pozitivně nabitou vrstvu v roztoku přilehlém k vnitřní stěně kapiláry. Po vložení elektrického napětí mezi elektrody na koncích kapiláry dochází k pohybu hydratovaných vodíkových protonů ve vzniklém elektrickém poli směrem ke katodě. Tyto vodíkové protony obalené molekulami vody strhávají veškerý roztok uvnitř kapiláry s sebou směrem ke katodě, čímž vzniká elektroosmotický tok. Lineární rychlost elektroosmotického toku je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a závisí na velikosti negativního náboje, který nese vnitřní stěna kapiláry. Čím je vyšší pH roztoku uvnitř kapiláry, tím větší negativní náboj je rozprostřen po vnitřní stěně a tím rychlejší elektroosmotický tok pozorujeme. Elektroosmotický tok vykazuje téměř rovinný rychlostní profil, který vede k velmi malému rozmývání zón separovaných látek, a proto se v elektromigračních separačních metodách setkáváme s mnohem užšímí píky než v HPLC.

Kapilární zónová elektroforéza (CZE = Capillary Zone Electrophoresis) dělí molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí (mobilit). Elektroosmotický tok separačního pufru uvnitř kapiláry unáší kladné i záporné ionty k detektoru a tyto ionty navíc migrují svými rozdílnými elektroforetickými rychlostmi uvnitř pufru, a tím se vzájemně dělí. Běhěm jednoho experimentu lze dělit a detekovat oba dva druhy iontů (kladné i záporné). Kapilární zónová elektroforéza je použitelná pouze pro nabité molekuly (ionty).

Kapilární gelová elektroforéza (CGE = Capillary Gel Electrophoresis) dělí velké molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí. Kapilára je naplněna gelem, který zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, jež jsou nuceny migrovat póry gelu. Přítomnost gelu zabraňuje vzniku elektroosmotického toku, a tak pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné) se pohybují směrem k detektoru a mohou být separovány a detekovány běhěm jednoho experimentu. Kapilární gelová elektroforéza je použitelná pouze pro ionty a využívá se zejména pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA.

Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC = Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) dělí nabité a především neutrální (hydrofobní a hydrofilní) molekuly na základě jejich rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi vodní a micelární fází. Do vodného pufru (vodná fáze) je přidána povrchově aktivní látka (detergent, např. SDS = sodium dodecylsulphate = dodecylsíran sodný), který vytváří v pufru micely tzv. micelární, pseudostacionární fázi. Povrchově nabité micely migrují uvnitř pufru vlastní elektroforetickou rychlostí a unáší molekuly a ionty separovaných sloučenin, které jsou více či méně přítomny uvnitř hydrofobních dutin (tj. prostůrků, interiérů popř. kavit) micel. Všechny micely migrují stejnou rychlostí, ale stupeň solvatace molekul micelami udává rychlost unášení těchto molekul micelami. Elektroosmotický tok pufru unáší micely a molekuly/ionty všech separovaných látek směrem k detektoru. Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie je použitelná pro neutrální molekuly a ionty.

Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (CE, CEC = Capillary Electrochromatography) dělí nabité i neutrální molekuly na základě jejich rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fáze je hnána pomocí elektroosmotického toku ložem stacionární fáze v naplněné kapiláře. Molekuly dělených látek jsou unášeny mobilní fází k detektoru a zároveň zpožďovány interakcí se stacionární fází. Tato technika je modifikací mikrokapalinové chromatografie (mikro HPLC, CLC) a je vhodná pro neutrální molekuly i ionty.

Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF = Capillary Isoelectric Focusing) dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pI (tj. pH, při kterém má molekula celkový náboj roven nule). Dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah pH. Z opačných konců migrují do kapiláry OH^- a H⁺ ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární pH gradient. Dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou pH, které se rovná jejich pI. V tomto místě kapiláry (pH = pI) se stanou neutrální, zastaví se a vytvoří úzkou zónu (fokusují). Po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány. Kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly (tj. molekuly, které mohou mít kladný, záporný anebo žádný celkový náboj podle pH okolního prostředí).

Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP = Capillary Isotachophoresis) dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit. Roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných pufrů. První pufr před vzorkem se nazývá vedoucí (leading) a obsahuje iont mající náboj stejného znaménka ale větší elektroforetickou pohyblivost než všechny separované ionty. Druhý pufr za vzorkem se nazývá uzavírající (terminating) a obsahuje iont stejného znaménka jako dělené ionty, ale má menší elektroforetickou pohyblivost než všechny dělené ionty. Každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu. Zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a uzavírající elektrolyt (pufr) a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů. Kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem (ionty). Během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné).

HISTORIE

první experimenty v U trubicích:
   F. von Reuss (1808)
   G. Wiedeman (1856)
   H. Buff (1858)
   O. Lodge (1886)
   W. Whetham (1893)

1897 F. Kohlrausch odvodil rovnici pro migraci iontů v roztoku elektrolytu

1.pol. 20.stol. gelová elektroforéza a isoelektrické fokusování na gelových deskách

1958 S. Hjertén ZE v rotujících trubicích 1-3 mm
1965 A. Tiselius ZE v 3 mm trubicích
1970 F. Everaerts ITP na vlastním přístroji
1974 R. Virtanen CZE v 200-500 μm skleněných kap.
1974 V. Pretorius EOF mobilní fáze sorbentem
1979 F. Mikkers CZE v 200 μm teflonových kapilár.
1981 J. Jorgenson, K. Lukacs CZE v 75 μm kapilárách
1983 S. Hjertén CGE pro biologické látky
1984 S. Terabe MEKC pro neutrální látky
1985 S. Hjertén CIEF pro biologické látky
1987 J. Knox, I. Grant CEC v 50 μm kapilárách s ODS
1987 B. Karger, A. Cohen vysoká účinnost CGE pro DNA
1988 dostupnost prvního komerčního přístroje (Beckman Instruments)

NÁZVOSLOVÍ

ACE
   affinity capillary electrophoresis
CAE
   capillary affinity electrophoresis
CE
   capillary electrophoresis
CEC
   capillary electrochromatography
CES
   capillary electroseparation
CD-MEKC
   cyclodextrin micellar electrokinetic chromatography
CGE
   capillary gel electrophoresis
CIEF
   capillary isoelectric focusing
CITP
   capillary isotachophoresis
CMEC
   capillary micellar electrokinetic chromatography
CZE
   capillary zone electrophoresis
EC
   electrochromatography
EKC
   electrokinetic chromatography
FSCE
   free solution capillary electrophoresis
FZE
   free zone electrophoresis
HPCE
   high performance capillary electrophoresis
HPE
   high performance electrophoresis
HPZE
   high performance zone electrophoresis
MEC
   micellar electrokinetic chromatography
MECC
   micellar electrokinetic capillary chromatography
MEKC
   micellar electrokinetic chromatography
MEEKC
   microemulsion electrokinetic chromatography
OTEC
   open tubular electrochromatography
SEKC
   suspension electrokinetic chromatography

OPTIMALIZACE SEPARACE

CZE
   pH
   druh a koncentrace pufru
   komplexační činidla
   organická rozpouštědla
   Mg²⁺, Ca²⁺
   chirální činidla

MECC
   druh a koncentrace detergentu
   pH
   druh a koncentrace pufru
   organická rozpouštědla

CEC
   druh stacionární fáze
   druh organického rozpouštědla
   koncentrace organického rozpouštědla
   pH
   chirální činidla

soubor pdf: ces.pdf

[ Domovská stránka | Separační metody | HPLC | GC | CES | CZE | MECC | CEC | TLC a PC | Extrakce, GPC, IEC a AC | Otázky | Cvičení | Témata | Kvalitativní analytická chemie | Základní praktika | Seminář z analytické chemie | Analytické separační metody ]