Cviceni ze separacnich metod<br>

Cvičení ze separačních metod
MC230P05 a MC230P51

1. HPLC
Vzorek obsahující polyaromatické uhlovodíky byl analyzován reverzní HPLC na koloně 300 × 4 mm ID naplněné stacionární fází Nucleosil 10 C18. Jako eluent byla použita směs acetonitril - voda (100 : 40, v/v) při průtoku 0,8 ml/min a tlaku 106 bar. Při analýze bylo na kolonu dávkováno 20 μl kapalného vzorku obsahujícího methanol jako rozpouštědlo. Byla použita UV absorpční fotometrická detekce při 254 nm. V chromatogramu byly zaznamenány pouze tři píky, z nichž první odpovídal methanolu obsaženému ve vzorku. Před provedením této analýzy byly změřeny retenční faktory benzenu, naftalenu, bifenylu, fenanthrenu a anthracenu na stejné koloně za stejných experimentálních podmínek a byly získány hodnoty uvedené v následující tabulce.

látka             k_i
benzen            1,12
naftalen          1,23
bifenyl           1,69
fenanthren        2,18
anthracen         2,73

a) Určete mrtvý čas a vypočítejte mrtvý objem použité separační kolony.
b) Určete retenční časy a vypočítejte redukované retenční časy obou neznámých látek.
c) Vypočítejte retenční objemy, redukované retenční objemy a retenční faktory obou neznámých látek.
d) Porovnáním retenčních faktorů identifikujte obě neznámé látky.
e) Určete výšku píku a šířku píku v polovině výšky pro oba identifikované analyty.
f) Vypočítejte plochy píků obou identifikovaných analytů.
g) Vypočítejte počty teoretických pater a výškové ekvivalenty teoretického patra dané separační kolony pro oba identifikované analyty.
h) Vypočítejte rozlišení píků pro identifikované látky.
i) Vypočítejte porozitu kolony.

2. HPLC
Stejný HPLC systém, který byl popsán v předcházejícím příkladě, byl použit ke kvantitativnímu stanovení obou identifikovaných analytů ve vzorku polyaromatických uhlovodíků analyzovaném již v předcházejícím příkladě.

První analyt byl stanoven metodou kalibrační přímky. Roztoky prvního analytu o koncentraci 20 až 100 mg/ml v methanolu byly postupně analyzovány na HPLC chromatografu použitím 20 μl dávkovací smyčky. Z chromatogramů zaznamenaných při stejné rychlosti posuvu papíru, jaká byla použita již při analýze vzorku, byly vyhodnoceny plochy píků v mm², jež jsou uvedeny v následující tabulce.

koncentrace           plocha píku
1.analytu             [mm²]
20 μg/ml               508
40 μg/ml               984
60 μg/ml              1518
80 μg/ml              1973
100 μg/ml              2509

a) Vypočítejte koncentraci prvního analytu v analyzovaném vzorku v μg/ml.

Druhý analyt byl stanoven metodou standardního přídavku. Ke vzorku o objemu 10 ml, který byl analyzován již v prvním příkladě, byly postupně přidávány standardní přídavky o objemu 20 μl obsahující 5 mg/ml druhého identifikovaného analytu a po promíchání vzorku se standardním přídavkem byl vzorek opět analyzován za stejných experimentálních podmínek. Z chromatogramů zaznamenaných při stejné rychlosti posuvu papíru, jaká byla použita již při analýze vzorku, byly vyhodnoceny plochy píku v mm² a ty jsou uvedeny v následující tabulce.

celkový objem přídavku    plocha píku
2.analytu                 [mm²]
20 μl                      1905
40 μl                      2594
60 μl                      3287
80 μl                      3962

b) Vypočítejte koncentraci druhého analytu v analyzovaném vzorku v μg/ml.

3. HPLC
HPLC s amperometrickou detekcí byla použita pro kvantitativní stanovení 2,4,5-trichlorfenolu ve vzorcích odpadních vod. Separace byla prováděna na koloně 250 x 4,6 mm ID naplněné stacionární fází Nucleosil 5 C18 s eluentem methanol - voda (7 : 3, v/v) obsahujícím 2 g/l KNO₃ a 0,05 g/l H₂SO₄ při průtoku 0,9 ml/min. Pracovní elektroda amperometrického detektoru ze skelného uhlíku byla polarizována na +1V vůči referentní argentchloridové elektrodě. 2,4,5-trichlorfenol byl stanovován metodou vnitřního standardu s fenolem jako vnitřním standardem. Tato metoda byla zvolena, protože odezva detektoru klesala s časem z důvodu pasivace pracovní elektrody. Před vlastní analýzou vzorku bylo analyzováno pět roztoků 2,4,5-trichlorfenolu o objemu 5 ml obsahujících zvyšující se koncentraci 2,4,5-trichlorfenolu od 2 do 10 μg/ml, k nimž bylo přidáno 50 μl roztoku fenolu o koncentraci 0,5 mg/ml. Vyhodnocené plochy píků 2,4,5-trichlorfenolu a fenolu ze získaných chromatogramů jsou uvedeny v následující tabulce.

roztok
2,4,5-trichlorfenolu (T)                 plocha     plocha
a fenolu (F)                             píku T     píku F
2μg/ml T (5ml) + 50μl F (0,5mg/ml)      17437      30106
4μg/ml T (5ml) + 50μl F (0,5mg/ml)      32027      27653
6μg/ml T (5ml) + 50μl F (0,5mg/ml)      43383      24962
8μg/ml T (5ml) + 50μl F (0,5mg/ml)      51915      22415
10μg/ml T (5ml) + 50μl F (0,5mg/ml)      57387      19809

Poté bylo přidáno k 5 ml vlastního vzorku 50 μl fenolu o koncentraci 0,5 mg/ml a takto vzniklý vzorek s vnitřním standardem byl analyzován za stejných experimentálních podmínek. Ze získaného chromatogramu byly vyhodnoceny plochy píků 2,4,5-trichlorfenolu a fenolu uvedené v následující tabulce.

analyt                 plocha píku
2,4,5-trichlorfenol    38671
fenol                  16386

Vypočítejte koncentraci 2,4,5-trichlorfenolu ve vzorku v μg/ml.

4. CZE
Fenoly ze 30 ml odpadních vod byly zakoncentrovány pomocí SPE a zachycené fenoly byly vymyty 0,5 ml methanolu. Takto vzniklý vzorek fenolů v methanolu byl analyzován pomocí CZE na přístroji Crystal CE 310. Použitá separační kapilára měla 75 μm i.d., 60 cm délku k detektoru a celkovou délku 75 cm. Jako separační pufr byl použit 20 mM tetraboritan sodný o pH = 9,2. Vzorek byl dávkován tlakem 10 mbar po dobu 0,10 min. Analýza byla prováděna při 25 kV, kdy kolonou protékal proud 72 μA. Použitá vlnová délka u absorpčního fotometrického detektoru byla 210 nm. Při analýze byl získán následující elektroferogram s výsledkovou tabulkou.

a) Identifikujte, které z následujících fenolů byly přítomny v odpadní vodě, jestliže znáte jejich kyselé disociační konstanty a iontové mobility, jež jsou uvedeny v následující tabulce.

látka                     pK_a       -m_A- [10^-4 cm²/Vs]
4-chlor-3-methylfenol     9,54       3,17
pentachlorfenol           4,50       3,35
2-chlorfenol              8,48       3,47
fenol                     9,89       3,64
2,4-dinitrofenol          4,00       3,87
2-nitrofenol              7,23       3,95
4-nitrofenol              7,15       4,10

b) Vypočítejte koncentraci pentachlorfenolu v odpadních vodách v mg/l, jestliže byla získána následující kalibrační křivka pro pentachlorfenol v methanolu proměřená za stejných experimentálních podmínek.

koncentrace           plocha píku podělená
pentachlorfenolu      migračním časem
0,5 mg/ml              63,7
1,0 mg/ml             135,6
1,5 mg/ml             209,5
2,0 mg/ml             260,4
2,5 mg/ml             337,3

Ze změřených hodnot pro kalibrační přímku byly získány následující regresní parametry pomocí lineární regresní analýzy provedené v programu Origin. (Y = plocha píku podělená migračním časem, X = koncentrace)

Linear Regression: Y = A + B * X
-----------------------------------
Param     Value      sd
A          -0.3      7.364
B         134.4      4.441
-----------------------------------
R = 0.99837
SD = 7.0214, N = 5

5. PC
Vyhodnoťte následující úkoly u chromatogramu papírové chromatografie dinitrofenylderivátů aminokyselin z přednášky.
a) Vypočítejte retardační faktory dinitrofenylderivátů aminokyselin.
b) Vypočítejte relativní retardační faktory dinitrofenylderivátů aminokyselin vzhledem k dinitrofenylderivátu methioninu jako standardu.

6. TLC
Vyhodnoťte následující úkoly u chromatogramu tenkovrstvé chromatografie steroidních hormonů z přednášky.
a) Vypočítejte retardační faktory všech tří steroidních hormonů.
b) Vypočítejte relativní retardační faktory všech tří steroidních hormonů vzhledem k estradiolu jako standardu.
c) Vypočítejte R_M a retenční faktory (k_i) všech tří steroidních hormonů

soubor pdf: cviceni.pdf