Capillary Zone Electrophoresis, CZE


ELEKTROMIGRAČNÍ SEPARAČNÍ METODY

1) Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
2) Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
3) Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC)
4) Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC)
5) Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF)
6) Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP)


Kapilára z křemenného skla (fused silica) s vnější vrstvou polyimidu
    vnitřní průměr : 50 , 75 nebo 100 μm
    vnější průměr : 375 μm




Využití dvou transportních jevů :
1. elektroforetická migrace iontů
2. elektroosmotický tok kapaliny


ELEKTROFORETICKÁ MIGRACE





elektroforetická rychlost : vef,i [m/s]
elektroforetická pohyblivost : mef,i [m2/Vs]












Iont    ri [nm]    rh [nm]    mi [10-4 cm2/Vs]
Li+     0,152      0,380      4,01
Na+     0,186      0,316      5,19
K+      0,227      0,272      7,92
Rb+     0,248      0,268      8,06
Cs+     0,265      0,268      8,00
 ri iontový poloměr
rh poloměr hydratovaného iontu
mi limitní iontová pohyblivost

Iont      mi [10-4 cm2/Vs]
NO2-      -7,44
NO3-      -7,40
SO42-     -8,29
HSO4-     -5,18
 mi limitní iontová pohyblivost


elektroforetická pohyblivost
   limitní iontová pohyblivost – při nekonečném zředění, tj. při I → 0
   aktuální iontová pohyblivost – při jisté koncentraci elektrolytů v roztoku, tj. při I > 0

efektivní poloměr iontu souvisí s hydratační sférou iontu
efektivní náboj iontu souvisí s iontovou sílou roztoku, která se projevuje retardačním a relaxačním efektem


ELEKTROOSMOTICKÝ TOK (ELEKTROOSMÓZA)



von Smoluchovského rovnice:
  

L = 0,5 m, U = 30 000 V, meof = 0,0005 cm2/Vs → veof = 3 mm/s


ELEKTRICKÁ DVOJVRSTVA



 


POVRCHOVÝ NÁBOJ

    ,     pK = 5,5

 


ZETA POTENCIÁL ( ζ )






RYCHLOSTNÍ PROFIL



TEPLOTNÍ PROFIL

Jouleovo teplo :
  



chlazení kapiláry :
    a) vzduchem
    b) kapalinou


CZE - PŘÍSTROJ




CZE - SEPARAČNÍ MECHANISMUS

rychlost zóny :


                                   ELEKTROFEROGRAM

 


POČÍTÁNÍ POHYBLIVOSTÍ

tmig,i , teof        ld , lc , U











mef,i > 0 pro kationty
mef,i < 0 pro anionty
mpoz,i > 0 pro oboje, pokud


SLABÉ ELEKTROLYTY (kyseliny)

HA + H2O ↔ A- + H3O+







meff,HA efektivní elektroforetická pohyblivost
mA- iontová pohyblivost




SLABÉ ELEKTROLYTY (zásady)

BH+ + H2O ↔ B + H3O+







meff,B efektivní elektroforetická pohyblivost
mBH+ iontová pohyblivost




VÍCESYTNÉ ELEKTROLYTY

kyselina m-hydroxybenzoová

pKa,1 = 4,06 ; mef,HA- = -3,36∙10-4 cm2/Vs
pKa,2 = 9,92 ; mef,A2- = -5,38∙10-4 cm2/Vs



distribuční diagram                                                efektivní mobilita

 


PUFRY

tetraboritan sodný, Na2B4O7, pKa = 9,2
kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 2,1, mi = -3,4
kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 7,2, ;mi = -5,8
kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 12,7, mi = -7,1
kyselina octová, octan, CH3COOH, pKa = 4,8, mi = -4,2
kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 3,1, mi = -3,1
kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 4,8, mi = -5,4
kyselina citronová, citrat, C6H8O7, pKa = 6,4, mi = -7,0
MES, O(CH2CH2)2N-CH2CH2-SO3H, pKa = 6,1, mi = -2,7
MOPS, O(CH2CH2)2N-CH2CH2CH2-SO3H, pKa = 7,2, mi = -2,4
TRIS, (HOCH2)3C-NH2, pKa = 8,1, mi = 2,9
CHES, CH2(CH2CH2)2CH-NH-CH2CH2-SO3H, pKa = 9,5
CAPS, CH2(CH2CH2)2CH-NH-CH2CH2CH2-SO3H, pKa = 10,4
   mi [10-4 cm2/Vs] iontová mobilita


VLIV KONCENTRACE PUFRU

1 tyramin, 2 thiomočovina, 3 uracil, 4 m-nitrofenol, 5 kyselina benzoová, 6 o-nitrofenol



Na2B4O7        meof [cm2/Vs]        R5,6
20 mM         8,08·10-4            2,24
10 mM         8,33·10-4            1,49
 5 mM         8,90·10-4            0,85
 2,5 mM       9,74·10-4            0

VODIVOST ELEKTROLYTÙ a MOBILITA

specifická vodivost :
       

molární vodivost :
       











molární vodivost :
  

ekvivalentová vodivost :
  






ÚČINNOST SEPARACE




rozmývání zón difúzí :
  





z elektroferogramu :

  

  

celkové H:

   H = Hdávkování + Hdifúze + Hadsorpce + HJouleovo teplo + Helektrokinetická disperse + Hdetekce


ROZLIŠENÍ



  

  



  

  






DÁVKOVÁNÍ VZORKU




DETEKCE v CZE

1. absorpční fotometrický detektor (UV, VIS)
    přímá a nepřímá detekce
2. fluorimetrický detektor
3. vodivostní detektor
4. amperometrický detektor
5. detektor s diodovým polem (DAD)
6. hmotnostní spektrometr jako detektor


ANALYTICKÁ INFORMACE Z ELEKTROFEROGRAMU

RESULTS
 --------------------------------------------------
Peak     RT(min)    Height     Area        W0,5
--------------------------------------------------
1        3,422      0.329      0,633       0.029
2        4,203      2.669      8,885       0.054
3        7,115      3.791      9,256       0.039
4        7,942      0.463      1,156       0.042
5        8,072      1.077      2,949       0.044
--------------------------------------------------

 kvalitativní informace :
poloha píku - migrační čas → elektroforetická pohyblivost - druh látky
(metoda standardů)

kvantitativní informace :
plocha píku → množství, koncentrace látky
a) metoda kalibrační přímky
b) metoda standardního přídavku
c) metoda vnitřního standardu


CZE ANORGANICKÝCH ANIONTÙ

kapilára : 75 μm i.d., 61 cm, 72 cm
separační pufr : 5 mM K2CrO4 + 0,5 mM TTAB (pH = 8,0)
separační napětí : -15 kV (15 μA)
dávkování vzorku : 20 mBar / 6 s (≈ 13 nl)
nepřímá fotometrická detekce při 254 nm

píky :
   1. chloridy (18 mg/l; 0,2 ng ve 13 nl)
   2. sírany (69 mg/l; 0,9 ng ve 13 nl)
   3. dusitany (20 mg/l; 0,3 ng ve 13 nl)
   4. dusičnany (19 mg/l; 0,2 ng ve 13 nl)




CZE ANORGANICKÝCH KATIONTÙ

kapilára : 75 μm i.d., 51 cm, 51 cm
separační pufr : 20 mM kyselina citronová + 10 mM LiOH (pH = 2,8)
separační napětí : 30 kV (13 μA)
dávkování vzorku : 10 mBar / 6 s (≈ 9 nl)
vodivostní detekce

píky :
   1. K+ (195 mg/l; 2 ng v 9 nl)
   2. Na+ (115 mg/l; 1 ng v 9 nl)




CZE HERBICIDÙ

kapilára : 50 μm i.d., 40 cm, 47 cm
separační pufr : 20 mM fosforečnan (pH = 5,6) + 2 mM α-cyclodextrin
separační napětí : 25 kV
dávkování vzorku : 35 mBar / 4 s (≈ 4,5 nl)
přímá UV fotometrická detekce při 200 nm

píky :
   1. 4-(2,4-dichlorfenoxy)máselná kyselina
   2. 4-(4-chlor-2-metylfenoxy)máselná kyselina
   3. 2-(2,4-dichlorfenoxy)propionová kyselina
   4. 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina
   5. 4-chlor-2-metylfenoxyoctová kyselina
   6. 2-(2,4,5-trichlorfenoxy)propionova kyselina
   7. 2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina




CZE ROPINIROLU A JEHO NEČISTOT

kapilára : 50 μm i.d., 40 cm, 47 cm
separační pufr : 100 mM Na2B4O7 + 30 mM MgSO4 (pH = 8,7) s 20% CH3CN
separační napětí : 30 kV (33 μA)
dávkování vzorku : 11 nl ( 2 mg/ml )
přímá UV fotometrická detekce při 254 nm





soubory pdf:    preSM5.pdf    preSM6.pdf    czeA.pdf    czeB.pdf

[ Domovská stránka | Separační metody | HPLC | GC | CES | CZE | MECC | CEC | TLC a PC | Extrakce, GPC, IEC a AC | Otázky | Cvičení | Témata | Kvalitativní analytická chemie | Základní praktika | Seminář z analytické chemie | Analytické separační metody ] Analytické separační metody ]

24.1.1996 © Pavel Coufal