TLC a PC

Thin Layer Chromatography, TLC
Paper Chromatography, PC

PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE

a) papírová chromatografie (PC)
   rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v papíře a mobilní fáze je též kapalná

b) tenkovrstvá chromatografie (TLC)
   rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě a mobilní fáze je také kapalná
   adsorpční - stacionární fáze je tuhý adsorbent, který je součástí tenké vrstvy, a mobilní fáze je
                       kapalná

Princip dělení analytů při PC a TLC : Vzorek se nanese ve formě malé kulaté skvrnky na papír nebo tenkou vrstvu a poté se mobilní fáze nechá vzlínat póry papíru nebo tenké vrstvy. Mobilní fáze unáší dělené látky ze vzorku, které se více či méně zpožďují interakcí (rozpouštění nebo adsorpce) se stacionární fází, a tím se vzájemně dělí.

Vzorky rozpuštěné v těkavém rozpouštědle se nanáší na start.
Nanášíme 0,1% až 5% roztoky v množství 200 nl až 20 μl do skvrn o průměru 2 až 6 mm.
Chromatogram se vyvíjí v uzavřené chromatografické komoře, která je dobře nasycena parami mobilní fáze.

opakované vyvíjení (eluent o jiné polaritě)
dvojrozměrné vyvíjení

Vyvíjení se ukončí vybráním chromatogramu z vyvíjecí komory, když čelo mobilní fáze dosáhne téměř protilehlého okraje papíru či tenké vrstvy.
Čelo mobilní fáze se označí měkkou tužkou.
Chromatogram se vysuší a skvrny nebarevných analytů je třeba před vyhodnocováním chromatogramu detegovat použitím vhodné detekční metody.

Detekční metody

a) ponoření nebo postřik chromatogramu vhodným činidlem
H₂SO₄ (pouze TLC), KMnO₄, I₂

b) fluorescence luminoforů v UV záření

c) zhášení fluorescence tenkovrstvé desky nadopované fluorescenčním indikátorem

KVALITATIVNÍ VYHODNOCENÍ CHROMATOGRAMU

Jednotlivé separované analyty se charakterizují tzv. retardačním faktorem ( R_F ).

u_i rychlost skvrny i-tého analytu
u_m rychlost (čela) mobilní fáze
d_ivzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu
d_m vzdálenost čela mobilní fáze od startu

Analyty identifikujeme

a) porovnáním poloh skvrn analytů a standardů chromatografovaných na témže chromatogramu
b) porovnáním hodnot retardačních faktorů ( R_F ) analytů s publikovanými hodnotami změřenými za stejných experimentálních podmínek
c) porovnáním R_Mhodnot

R_M na rozdíl od R_F závisí aditivně na strukturních prvcích chromatografované látky
d) porovnáním hodnot relativních retardačních faktorů

R_F,rel,i je relativní retardační faktor
tj. retardační faktor chromatografované látky vztažený k retardačnímu faktoru standardu

KVANTITATIVNÍ VYHODNOCENÍ CHROMATOGRAMU

a) Analyty můžeme stanovit přímo na chromatogramu pomocí fotodenzitometru, který nám převede skvrny analytů na chromatogram s píky, jejichž plocha je úměrná množství příslušného analytu ve skvrně.

b) Analyty se extrahují z chromatogramu a stanoví se vhodnou metodou v roztoku.

PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE (PC)

rozdělovací chromatografie
celulózový filtrační papír (99 % α-celulózy)
Stacionární fází je většinou voda zachycená na papíře.
Jako mobilní fáze se používají organická rozpouštědla nebo jejich směsi, které se s vodou nemísí nebo mísí omezeně.
Chromatogramy lze vyvíjet sestupně, radiálně popř. vzestupně.
Vyvíjení chromatogramu v PC je pomalejší než v TLC

Sestupná PC aminokyselin

dinitrofenylderiváty aminokyselin

eluent : cyklohexan 60%, isopropanol 36%, 50 mM benzoát draselný 4%
detekce : žluté skvrny

TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE

TLC je jednoduchá, rychlá a často používaná chromatografická metoda, se kterou se dají realizovat všechny metody kapalinové chromatografie.

Tenkovrstvou chromatografii lze charakterizovat jako chromatografii v otevřené koloně.

Na tenké vrstvě je podstatně méně stacionární fáze, a tudíž analýza na tenké vrstvě může být velmi rychlá v porovnání s kolonou.

Všechny nanesené látky se musí objevit mezi startem a čelem rozpouštědla; nic nemůže zůstat v koloně.

Tenkovrstvou chromatografii je možno realizovat v klasické (TLC) nebo vysokoúčinné (HPTLC) experimentální podobě.

TLC

Používají se prakticky všechny stacionární fáze jako pro kolonovou chromatografii se zrnitostí 5 až 40 μm.

Stacionární fáze : oxid hlinitý, silikagel, celulóza, iontoměniče, polyamid a silikagel s -C18, -NH₂ nebo -CN skupinami

Stacionární fáze jsou naneseny na skleněných deskách nebo hliníkových fóliích.

Tenké vrstvy mohou obsahovat fluorescenční indikátor UV₂₅₄ k usnadnění detekce analyzovaných látek.

Mobilní fáze : cyclohexan, toluen, chloroform, dichlormetan, aceton, ethanol, methanol, voda, amoniak, kyselina octová a jejich směsi

HPTLC

Používají se stejné druhy stacionární fáze jako v TLC, avšak s velmi malou zrnitostí a velkou homogenitou zrnitosti.

Mobilní fáze se dodávají na vrstvu pomocí mikročerpadel (F_m ≈ 1 μl/s) pro zajištění rovnoměrného toku eluentu tenkou vrstvou.

Vyvíjení chromatogramu probíhá ve vyvíjecích komorách s možností regulace složení plynné fáze, neboť průtok eluentu tenkou vrstvou závisí na tlaku a složení páry (plynné fáze) nad vrstvou.

TLC ŠTĚPŮ NUKLEOVÝCH KYSELIN

tenká vrstva : Nano-SIL NH₂ / UV
eluent : aceton/voda 30/70 (v/v) + 0,2M (NH₄)₂SO₄
objem vzorku : 0,3 μl
detekce : fotodozimetr, UV při 254 nm

píky :
   1. UTP (uridinmonofosfát)
   2. UDP (uridindifosfát)
   3. UMP (uridintrifosfát)
   4. uridin (uracil-ribóza)

TLC BARBITURÁTŮ

tenká vrstva : RP-18W / UV₂₅₄ (W = wettable, smočitelná, nesilanizovaná)
eluent : metanol/voda 45/55 (v/v)
detekce : fotodozimetr, UV při 254 nm

píky :
   1. Revonal
   2. Prominal
   3. Luminal

TLC PESTICIDŮ

tenká vrstva : Nano-DURASIL-20 UV₂₅₄eluent : chloroform/aceton 95/5 (v/v)
detekce : fotodozimetr, UV při 254 nm

píky :
   1. Desethylatrazin
   2. Hexazinon
   3. Simazin
   4. Atrazin
   5. Crimidin

TLC STEROIDNÍCH HORMONŮ

tenká vrstva : Nano-SIL CN / UV
eluent : petroleter(40-60°C)/aceton 80/20 (v/v)
objem vzorku : 1 μl
detekce : 0,2 g MnCl₂ v 60 ml metanolu s 2 ml H₂SO₄, fotodozimetr, UV při 366 nm

píky :
   1. estriol
   2. estradiol
   3. estron

soubor pdf: tlcpc.pdf